益生菌，包括乳酸杆菌，双歧杆菌，肠球菌，链球菌，甲孢菌，乳杆菌和一些酵母通常存在于人胃肠道，发酵牛奶和其他乳制品，人类粪便和母乳中。菌株的来源和在胃肠道中到达靶位点的能力是重要的。在整个胃肠过境过程中，菌株必须能够在不同的生理化学，酶促和微生物应力上存活，然后在对宿主的健康表现出有益的影响之前。它们可以改善肠道微生物平衡并刺激丁酸丁酯生产，这促进了上皮细胞的生长，导致肠和结肠粘膜厚度的增加，以更好地吸收营养素。它们还能产生多种具有拮抗病原体特性的代谢最终产物。这些产品包括杀菌蛋白质和抗生素样代谢物称为杀菌菌素（如尼本质）。几种细菌素的抑制光谱包括食物腐败的微生物和/或食品传播的病原体。细菌素被认为是安全的天然防腐剂或生物防腐剂，因为它假设它们可以通过胃肠道中存在的蛋白酶降解。联合工作组粮食援助组织/世界卫生组织制定了可用于评估食物中的益生菌的指导方针。最低要求包括评估应变身份和安全性，以及对目标主体的健康益处的研究。 The continuous search for novel probiotics of importance in medical, industrial and agricultural environments is ongoing around the word. This review summarizes the current state of evaluation criteria for determining the candidacy of novel probiotics.

益生菌，细菌素，胃肠道，体内研究，酶，乳酸菌，世界卫生组织，粮食援助组织。

益生菌，包括乳酸杆菌，双歧杆菌，肠球菌，链球菌，甲孢菌，乳杆菌和一些酵母通常存在于人胃肠道，发酵牛奶和其他乳制品，人类粪便和母乳中。菌株的来源和在胃肠道中到达靶位点的能力是重要的。在整个胃肠过境过程中，菌株必须能够在不同的生理化学，酶促和微生物应力上存活，然后在对宿主的健康表现出有益的影响之前。它们可以改善肠道微生物平衡并刺激丁酸丁酯生产，这促进了上皮细胞的生长，导致肠和结肠粘膜厚度的增加，以更好地吸收营养素。它们还能产生多种具有拮抗病原体特性的代谢最终产物。这些产品包括杀菌蛋白质和抗生素样代谢物称为杀菌菌素（如尼本质）。几种细菌素的抑制光谱包括食物腐败的微生物和/或食品传播的病原体。细菌素被认为是安全的天然防腐剂或生物防腐剂，因为它假设它们可以通过胃肠道中存在的蛋白酶降解。联合工作组粮食援助组织/世界卫生组织制定了可用于评估食物中的益生菌的指导方针。最低要求包括评估应变身份和安全性，以及对目标主体的健康益处的研究。 The continuous search for novel probiotics of importance in medical, industrial and agricultural environments is ongoing around the word. This review summarizes the current state of evaluation criteria for determining the candidacy of novel probiotics.

益生菌，细菌素，胃肠道，体内研究，酶，乳酸菌，世界卫生组织，粮食援助组织。

益生菌通常被认为是那些在与食物一起摄取或消耗的宿主之前为其宿主提供有益健康影响[1]。Metchnikoff是1908年保加利亚农民中观察到的第一个人的第一个人，这是与活乳酸菌（实验室）强化酸奶的连续消费的结果[1]。

乳酸菌包括乳酸菌、双歧杆菌、肠球菌、链球菌、芽孢杆菌、乳球菌和一些酵母作为益生菌已被广泛报道，因此，它们在人类胃肠道(GIT)、发酵乳等乳制品、人类粪便和母乳[2]中占主导地位。乳酸菌和双歧杆菌都是肠道中革兰氏阳性、非致病性杆状菌或球菌的成员，Int J Food Biosci 2018 20是报道最多的益生菌菌株属;两者都是过氧化氢酶阴性，兼性厌氧菌，生长在糖和产生乳酸作为最终产物[3-5]。益生菌是根据被认为对确保其有效性很重要的标准来识别的。这些标准可能包括菌株的来源和到达胃肠道靶点的能力，因此菌株必须能够在整个胃肠道运输过程中在不同的物理化学、酶和微生物胁迫下生存。胃的酸性环境中微生物可以被迫经历的压力低pH值和高胆盐,后的应变能在胃肠道,因为它必须与已经存在微生物群落提供营养。要获得这样的竞争优势，也需要粘附或附着在覆盖肠道上皮的黏液表面的能力[1,6]。

益生菌被认为是通过直接影响肠道微生物群落来提供有益于宿主健康的效果，即它们改善肠道微生物平衡并刺激丁酸盐的产生，这促进了上皮细胞的生长，导致盲肠和结肠黏膜的厚度增加，以更好地吸收营养物质[7,8]。它们还能产生多种具有拮抗病原体特性的代谢最终产物。这些产品包括杀菌蛋白和类似抗生素的代谢物，称为细菌素。

主要表征由益生菌产生的活性成分是菌杂菌素（例如尼沙素），其被认为是安全的天然防腐剂或生物保护剂，因为它假设它们可以通过Git中存在的蛋白酶降解[9]。几种细菌素的抑制光谱包括食物腐败微生物和/或食物传播病原体[10,11]。

持续搜索医疗，工业和农业环境重要性的新益生菌正在围绕这个词在进行中。潜在的益生菌必须能够通过基本的益生菌属性测试，在胃肠道条件下存活，特别是在低pH和高胆汁浓度下，产生抗微生物化合物并粘附到肠粘膜上。本综述总结了确定新型益生菌候选性的评估标准的当前状态。

在当代生活中，对人类有益健康影响的活细菌通常被称为益生菌。益生菌是一种从希腊语中创造的词，意思是“生命”[12]。益生菌词已经给出了许多类似的定义。Lilly和Stillwell描述了益生菌作为“由一种微生物分泌的物质，它刺激另一个微生物的生长”[13]。它也被帕克定义为“有助于肠道微生物平衡”的“生物”[12]。富勒随着另一种定义：“一种通过改善肠道微生物平衡”[12]精益地影响宿主的活微生物补充剂。粮食和农业组织（粮农组织）和世界卫生组织（WHO）将益生菌定义为活着微生物文化，当时以足够的数量消耗时为主持人提供健康益处[14]。粮农组织/世卫组织的定义是益生菌最批准和广泛接受的定义。这种微生物可能不一定是Git的永久居民，但这些微生物应该对宿主的一般健康有益效果。“与食物有关，益生菌被认为是食品或膳食补充剂中可行的制剂，以改善人类和动物的健康”[15]。

metch尼科夫声称，酸奶中发现的乳酸菌抑制了肠道中产毒细菌的增殖，从而延长了宿主[14]的寿命。随着时间的推移，埃利·麦切尼科夫的说法得到了证实。例如，一种被称为EcN的大肠杆菌菌株在德国[16]成功地用于治疗便秘和结肠炎。1906年，Tissier在母乳喂养的婴儿中发现了双歧杆菌，据报道，它可以调节患有肠道疾病的婴儿的微生物菌群，具有临床益处。另一种益生菌凝固芽孢杆菌用于缓解类风湿性关节炎[1]。

现在，益生菌可以从广泛的活菌补充剂中获得，用于改善健康[3,7]。益生菌对宿主的有益作用是通过益生菌菌株的生长和活性以及其在目标位点[6]上的存活和有效能力。粮农组织/世卫组织联合工作组制定了可用于评估食品中的益生菌的准则。最低要求包括:评估品系特征，如属和种;体外测试益生菌的潜在特性，如对胆汁酸和消化酶的抗性;确保不受污染的安全评估;对宿主[6]健康影响的体内研究。

益生菌属于葡萄球菌、链球菌、乳杆菌、双歧杆菌和肠球菌，已从人类母乳、植物和肉类食品、人和动物粪便材料、动物肠道等多种来源中分离出来[17,18]。常见的益生菌如图1所示。然而，LAB是大多数被认为是益生菌的微生物，可以从发酵食品中分离出来，如酸奶和开菲尔[3,14,16]。大多数发酵乳制品都含有大量的乳酸菌，这使它们成为益生菌[5]的有用来源。

通过帮助减轻乳糖不耐受，粪便减少并治疗某些类型的腹泻，已经证明益生菌对宿主具有有益的影响。旅行者的腹泻。益生菌的摄入或消费是以多种不同的方式进行的，因为制备了许多含有益生菌的食品，包括颗粒饲料，发酵饲料，糊剂和粉末[7]。其他益生菌来源包括奶酪，谷物，冰沙，婴儿和幼儿配方和营养棒。益生菌通常作为药物，医疗食品和膳食补充剂出售，其中益生菌可以干燥，并包装成胶囊，片剂或小袋[19,20]。

每种选定的益生菌菌株必须是纯的，但是当与纯菌株的组合使用时，应当已知各自的比例。益生菌必须是非致病性和无毒的，能够帮助人体系统的健康功能，因此，应完全表征和鉴定选择作为益生菌的菌株。

革兰氏染色反应是用于检测样品中细菌的存在和形态的标准实验室程序。其结果通常被解释为革兰氏阳性或革兰氏阴性。它能相对快速地得出样品中存在的细菌类型。革兰氏染色包括在玻片上准备一个纯细菌分离涂片，并让它干燥。然后用特殊染料染色，脱色，然后反染色。该程序是基于微生物在革兰氏染色反应中保留染色剂/染料颜色的能力。用酒精可使革兰氏阴性菌脱色，失去原色的紫色，呈现出反色的粉红色。革兰氏阳性细菌不会被酒精脱色，并且会保留原色/染料的紫色。革兰氏染色是鉴定[22]益生菌的一个非常重要的起始步骤。

此外，这也是筛选潜在感染/致病菌的重要步骤，以便这些不希望分离的菌会立即作为候选菌或潜在益生菌脱落。益生菌最常见的形态如下:

扫描电子显微镜（SEM）可用于观察和识别从液体培养的研究中的细菌的形状和表面结构。国家描述了使用SEM [23]的详细程序。

过氧化氢酶生产试验是另一个重要的初步筛选步骤，酶催化过氧化氢分解为氧和水。过氧化氢酶试验通常是在一个单独的分离菌落上进行的，在玻片上取下划线，并在涂片上加一滴15%的过氧化氢。氧的泡腾表明细菌对过氧化氢酶试验[24]有阳性反应。过氧化氢酶试验简单，是识别过氧化氢酶阳性细菌的诊断试验之一。在进行过氧化氢酶试验时，如果未观察到气泡，说明分离的细菌过氧化氢酶为阴性，不能介导H2O2分解为O2[25,26]。一般情况下，需氧培养用3% (v/v) H2O2，厌氧菌过氧化氢酶检测用15% (v/v) H2O2。用于试验的培养物不应超过24小时。过氧化氢酶试验的主要用途是区分形态/结构相似的肠球菌或链球菌(过氧化氢酶阴性)和葡萄球菌(过氧化氢酶阳性)，以及好氧细菌和专性厌氧细菌。

使用不同的糖基材进行糖发酵试验，例如阿拉伯糖，蔗糖，麦芽糖，乳糖，山梨糖醇和葡萄糖[28]。约0.1g每种糖基质将加入100ml培养基（0.1％，w / v）中。将5ml含糖培养基转移到不同的试管中。对于气体检测，Durham管将插入含有不同糖的试管中，用指示剂（用于在糖发酵过程中的颜色变化）。所有管将在121℃下灭菌15分钟。然后将管接种在研究中用单个细菌殖民地接种。阳性反应将通过气泡的外观和/或培养基颜色的变化来表示。

Biolog是一种自动化系统，该系统是在1989年首次介绍的。PyAR和PEH描述了测试许多厌氧细菌的碳水化合物利用光谱的详细程序[28]。将分离的细菌在37℃下在37℃下培养48-72小时。来自琼脂夫人的单个细胞殖民地现在在脑心脏输注（BHI）培养基中培养36-48小时。然后将培养的细菌悬浮在厌氧生物液中。使用Biolog浊度计监测和测量悬浮液的浊度直至达到65％的透射率。然后将悬浮液（100μl）移液到Biolog Micropletm的99个孔中的每一个中。然后将该板在37℃下在仅使用无氧气氛试剂盒的厌氧罐中在37℃下孵育24小时。然后将孵育后的板插入Biolool自动分析系统中，使用Biolog软件进行识别过程[28]。

一个潜在的益生菌候选人应该有更多的可取的特性，这些特性应该在新菌株和益生菌产品的开发过程中进行评估。然而，没有一个候选人应该通过所有的益生菌质量属性。

益生菌菌株的原始来源是需要考虑的重要因素之一，因为肠道菌群中已经存在的微生物物种可能有更好的机会在其自然环境中生存和耐受恶劣的胃肠道条件[27]。微生物定殖GIT的能力通常被认为是潜在益生菌的主要选择标准之一。以下是一些新的益生菌候选人应该能够展示的标准。

该列表并不穷，但是非常有前景的益生菌菌株应该能够通过或固有地表现出大部分标准：

为了通过胃肠道存活，抗低pH值是很重要的。耐酸性是根据Hyrominus等人[29]所描述的方法进行测定的。乳酸菌菌株的细胞通常在37°C的deMan Rogosa Sharpe (MRS)培养液中培养过夜，然后在pH 2-3的新鲜MRS (3%， v/v)中进行继代培养。存活率CFU然后按照百分比计算孵化后37°C CFU相比分别为60到180分钟的时间0分钟。是否有50%的CFU 180分钟后,然后隔离判定是酸宽容,它假定它会容忍和生存GIT的酸性条件。

为了通过胃肠道生存，耐胆汁和胰酶的抗性很重要。通常使用Gilliland等[30]的改性方法进行胆耐耐受试验。通常，将乳杆菌菌株的晚对数培养物分别接种（3％，v / v）进入含有0.3,0.5和1.0％（w / v）oxgall的MRS肉汤中。与在0分钟的时间相比，在37℃下在37℃温育后，将存活率计算为CFU百分比。

通过在模拟的人胃肠道条件下测定分离物的活力来测量耐受性。Gilliland等[30]描述使用通过悬浮胃蛋白酶（3m​​g / ml）和胰蛋白USP（1mg / ml在无菌0.5％（w / v）的氯化钠溶液中的氯化钠溶液）制备的模拟胃和胰汁的方法，在pH值分别为3.0和8.0。然后将磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH7.0）中的细菌的约0.2ml洗涤的细胞悬浮液接种到1.0ml模拟的胃或胰腺中，0.3ml NaCl（0.5％，w / v）中并在37℃下孵育。将培养物温育180分钟，用于胃传输耐受性测定，对于小肠过渡耐受性测定，240分钟，因此，总活计数评价为CFU。

在人类和兽医中不受控制地使用抗生素，导致微生物中的抗生素抗性[31]。因此，检查益生菌菌株是否可以用作共轭抗生素抗性基因的供体是一种明智的抑制措施，以缩短抗生素抗性的进一步扩散[32]。目前，抗菌性抗性微生物的蔓延是一个严重的公共卫生问题，“因此，最重要的是，为了抗生素抗性基因测试潜在的益生菌菌株”[33]，目的是清除捐赠流动抗生素的可能性肠道中致病微生物的抗性基因。不存在对临床相关抗生素的抗性的可转移基因也是理想的[34]。另外，应该确保从益生菌的基因组中不存在毒力基因，因此应评估所选益生菌菌株的安全性可能导致感染的潜在毒力因子[35]。“因为参与这些活动的基因可能存在但没有表达，因此应通过通过PCR技术和/或DNA杂交的缺乏缺乏关键基因来确认负表型结果[36]。然而，潜在的益生菌菌株中的抗微生物抗性通常不被认为是危险因素，除非这种抗性转移到病原体导致未治疗的感染[37]。

为了对结肠菌群有积极的影响，益生菌菌株对肠道病原体有拮抗作用是可取的。这可以通过抗菌物质(细菌素)的生产或竞争性排斥[31]发生。测定候选益生菌抗菌活性最常用的方法是琼脂孔扩散法。分离培养物可在MRS培养基中37℃孵育48小时。离心(10,000 x g, 10分钟)，无菌过滤，获得细胞游离上清。然后用平板法将目标菌株接种在固体Muller-Hinton琼脂培养基上进行24小时肉汤培养。然后在每个琼脂板上钻孔。然后用100 μL之前制备的细胞游离上清液填充孔。用未接种MRS肉汤接种的目标菌株培养皿作为对照。平板在37℃下孵育24小时，然后观察和测量抑制区域，更大的直径表明更高的抗菌活性。

血溶酪素产量通常分析含有5％（v / v）羊血液的哥伦比亚琼脂平板[37]。通过在菌落周围形成透明或绿区的形成表明β-或α-氧蛋白酶的存在。氧蛋白是一种非常常见的毒力因子，常见的病原体中经常导致宿主中的贫血和水肿，因此，不推荐用作益生菌的血液解菌株。因此，优选仅选择非溶血菌株作为益生菌候选物。

血清蛋白，胆固醇，葡萄糖，球蛋白和白蛋白等血液生物化学参数的益生菌效应应正常;血液中高浓度的白蛋白和球蛋白是感染和脱水的指示[38]。对血液学的益生菌作用I.e.摄入后的中性粒细胞和嗜碱性粒细胞也应保持在正常水平，因此，益生菌不应刺激更多的中性粒细胞和嗜碱性粒细胞的产生，这是一种感染的指示[39,40]。

肠道益生菌对免疫系统起免疫佐剂作用，可刺激抗体产生[41]。为了验证一种候选益生菌的抗体刺激潜力，通常收集等量的(2ml)血液样本到血清瓶中，以10,000 x g离心15分钟，然后用巴斯德吸管将分离出来的血清抽入5ml无菌离心管中。应在准备后12小时内完成。适当的酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒用于测定抗原-抗体反应程度。

一种良好的益生菌应该具有证明可行的抗氧化剂潜力的能力，并且益生菌可以以不同的主要方式表现出抗氧化活性[73]，其可包括通过分泌超氧化物歧化酶（SOD）等分泌酶，释放和促进生产来加强固有的细胞抗氧化防御主要的非酶促抗氧化剂（如外偶联，EPS）和自由基清除剂谷胱甘肽（GSH），表现出金属螯合活性。研究数据表明，益生菌可能在减少反应性氧物质（ROS）和对抗表征胃肠疾病方面具有潜在的治疗作用。

为了评价益生菌菌株的总抗氧化活性(TAA)，可以采用Kullisaar等人[42]所描述的亚麻酸(LA)试验。使用45 μL的样品(裂解液或整个细菌细胞)。使用分光光度计测量534 nm处的吸光度，样品中TAA的百分比表示为[1−(as /Ac)] × 100]，其中as是样品存在时的吸光度，Ac是没有样品时的对照品吸光度。还原性和氧化性谷胱甘肽以及谷胱甘肽氧化还原状态可以使用无细胞提取物和GSH/GSSG比值检测试剂盒进行评估。谷胱甘肽含量将在已知谷胱甘肽含量的标准曲线的基础上进行量化。还原谷胱甘肽(GSH)计算为总谷胱甘肽与氧化谷胱甘肽(GSSG)之间的差值。谷胱甘肽氧化还原比表示为GSH/GSSG。

选定的益生菌菌株的胞外酶生产测定通常是定量的，如Nandi等人[18]所述。他们对酶分析方法的描述如下。选定的菌株将在选定的用于生产酶的肉汤培养基中培养。淀粉汤、蛋白胨明胶汤、羧甲基纤维素汤和脂肪酶生产培养基分别用于淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶和脂肪酶的测定。将培养物摇匀(100-120 rpm, 30±1℃，72小时)。孵育后，离心(10000 x g, 10 min, 4℃)，收集上清液用于测定淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶的活性，根据Bradford assay[43]估算上清液中的蛋白含量。益生菌菌株不应该有β-葡萄糖醛酸酶活性，β-葡萄糖醛酸酶活性可能对结肠有负面影响，因为它与结肠癌的发病率有关(大多数癌细胞显示较高的β-葡萄糖醛酸酶活性)[44]。相反，能够产生β-半乳糖苷酶的菌株是理想的，因为它是一种有益的酶，支持减少乳糖不耐受和牛奶酸化[44]。[45]还需要能产生α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的菌株。肠道内的细胞外酶产生菌对宿主的消化过程有刺激作用。 Many bacterial enzymes can be very helpful for digesting carbohydrates, proteins and some special substrates such as cellulose, which can be digested only by a few animals. Therefore, prospecting and application of probiotics with enzyme producing ability is gaining more attention.

粘附使益生菌粘附在肠道粘膜壁上，防止病原菌在肠道内定植[46,47]，对病原菌具有拮抗活性，调节免疫系统，增强机体[48]的初级防御。检测自聚集能力、细胞表面疏水性和共聚集性的方法可用于初步鉴定有前途的粘附细菌[49]。

确定潜在的益生菌细菌菌株的抗抑制性和诱变诱变能力始终是一个良好的检查[50-53]。具有抗胁迫潜力的益生菌菌株将在预防肠道中的诱变中形成重要作用，并且可以用于治疗阻塞结肠癌。

许多益生菌作为食品或药物出售供人类食用。因此，益生菌的安全性是至关重要的。建立益生菌菌株最重要的特征之一是它必须是非致病性的，而且应该具有普遍公认的安全(GRAS)状态[74]。益生菌的细胞毒性是有选择性的;对宿主细胞是友好的对病原体和癌细胞是致命的尽管有很多研究，但益生菌诱导癌细胞细胞毒性和抗炎反应的机制仍知之甚少。

在产品的生产和储存过程中，益生菌菌株的生存能力和所需特性的维持是必要的。保质期[32]研究应定期进行，以评估益生菌菌株在一段时间内的生存能力。

含有食物的食物的消费可以提供一系列健康益处，包括免疫系统调制，对恶性肿瘤和传染病的抗性更强。此外，良好的益生菌细菌应该具有有效的胆固醇还原能力。根据Kumer和Coworkers [54]，益生菌有许多健康的生物学性质，其中一个是抗胆固醇同化。

最近，许多研究具有重要的证据，益生菌通过诱导吞噬细胞和IgA分泌，改性T细胞反应，增强Th1响应和衰减Th2反应来影响所获得的和先天免疫反应的若干方面，从而通过诱导吞噬细胞和IgA分泌，增强响应和衰减Th2响应[57]。益生菌已经表现出丰富的健康益处，除了提供基本的营养优势[58]，并且支持益生菌的有益索赔的证据增加了（图2）。这些包括改善肠道健康，增强免疫应答，降低血液胆固醇和癌症预防。这些卫生性能归因于不同的菌株并受到各种机制的影响[59]。几项研究报告了由于益生菌给药，特别是通过降低食品生产动物的抗生素消耗来促进益生菌的积极影响。这将最终降低环境中药物和多毒性生物的存在[60]。

益生菌是一个有前途的未来作为替代健康疗法。研究表明，益生菌对人类的有益效果可能是巨大的[61]。应在益生菌菌株上进行更多的研究，以检查它们对靶向人类疾病和条件的疗效，并进一步调查其赋予其赋予的有益效果的行动机制[62]。通过进一步研究其作用方式[61,62]，应更好地获得益生菌机制的了解。因此，应考虑对潜在的益生菌安全性的个人评估。因此，必须研究必须研究与潜在的益生菌菌株中的毒力和抗性因子相关的基因的存在。看来我们看来，在筛查菌株的候选性的更多研究将进一步了解所选择的候选菌株的能力，以殖民化，并且能够将胃肠道的病原体渗透，没有能力引发感染和/或引起任何消费时对人类造成伤害。

益生菌被纳入乳制品和非乳制品的食品中，以提高他们的营养和健康价值，这些食物可能包括酸奶，奶酪，婴儿配方，早餐谷物，香肠，巧克力和冰淇淋。实验室用于食品发酵，提供非常有价值的经济意义。例如，适应肠道的L.嗜酸杆菌的菌株能够发酵牛奶，在全球范围内的健康食品可获得温和酸化的酸奶，以产生温和的酸化酸奶[63-67]。

良好益生菌的选择背后的原则包括那些在胃肠道消费和生存中的安全性。益生菌菌株必须能够克服极低的pH和胆汁盐的乳化作用，并以可行的生理状态到达动作部位[68]。良好的益生菌也应该被免疫系统接受，它应该是无理体的，过敏反应，无致突变[69]，并且应该与宿主GI环境相容[70]。另外，良好的益生菌应该具有良好的能力，通过疏水性，自动聚集和共grgegation粘附在肠上皮细胞中。此外，益生菌微生物应该没有与腹泻的细菌有关，没有能够转移抗生素抗性基因[71]，没有毒力基因的表达[72]。对于实际和商业应用，益生菌必须在梯度上轻松培养，并且必须抵抗液体中的加热和低氧气等技术操作[20]。

感谢滑铁卢大学和南非农业研究理事会的支持。