也被称为乳糖酶，β-半乳糖苷酶(beta-gal或β-gal)，是一种糖苷水解酶，通过糖苷键的断裂催化β-半乳糖水解成单糖。含半乳糖的碳水化合物，其糖苷键位于半乳糖分子上方，是β-半乳糖苷的一个例子。神经节苷GM1、乳糖酰胺、乳糖和各种糖蛋白是β-半乳糖苷酶的不同底物。在分子生物学的历史和实践中，β-半乳糖苷酶(大肠杆菌)有着特殊的地位。在Jacob和Monod的基因表达调控操纵子模型的发展中，它发挥了基础性的作用。通过产生容易识别的蓝色反应产物，它有能力表明自己的存在，这使它成为克隆和其他分子生物学程序的主力。本文综述了β-半乳糖苷酶的功能、作用机理(化学和结构)、在生物技术中的应用、优缺点以及改性策略等方面的研究进展。

乳糖酶，β-半乳糖叶，大肠杆菌，神经节苷脂，乳糖酰胺。

也被称为乳糖酶，β-半乳糖苷酶(beta-gal或β-gal)，是一种糖苷水解酶，通过糖苷键的断裂催化β-半乳糖水解成单糖。含半乳糖的碳水化合物，其糖苷键位于半乳糖分子上方，是β-半乳糖苷的一个例子。神经节苷GM1、乳糖酰胺、乳糖和各种糖蛋白是β-半乳糖苷酶的不同底物。在分子生物学的历史和实践中，β-半乳糖苷酶(大肠杆菌)有着特殊的地位。在Jacob和Monod的基因表达调控操纵子模型的发展中，它发挥了基础性的作用。通过产生容易识别的蓝色反应产物，它有能力表明自己的存在，这使它成为克隆和其他分子生物学程序的主力。本文综述了β-半乳糖苷酶的功能、作用机理(化学和结构)、在生物技术中的应用、优缺点以及改性策略等方面的研究进展。

乳糖酶，β-半乳糖叶，大肠杆菌，神经节苷脂，乳糖酰胺。

β-半乳糖苷酶有三种酶活性，如图1所示。首先，它能将乳糖二糖分解成葡萄糖和半乳糖，然后进入糖酵解。其次，该酶能催化乳糖的反式半乳糖酰化为异丙乳糖，最后使异丙乳糖裂解为单糖。它是异丙乳糖结合lacZ阻遏物，并创建一个正反馈环路，调节细胞[1]中的β-半乳糖苷酶的数量。

X-GAL（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷），由与取代的吲哚连接的半乳​​糖组成的可溶性无色化合物与β-半乳糖苷酶反应，后者最能识别出该相互作用。对于β-半乳糖基材的半乳糖部分具有高特异性，但其余部分的特异性低。因此，当它水解X-GAL时产生不溶性的强烈的蓝色产物，释放自发地二胺的取代的吲哚。在含有X-GAL的生长培养基上，由于该反应，具有活性β-半乳糖苷酶的大肠杆菌的菌落成为蓝色。

在酶的单晶中，可以容易地进行X-加仑反应。作为一般蛋白质，β-半乳糖苷酶形成晶体，其包括约50％蛋白和50％溶剂的体积。在整个晶体中延伸，溶剂填充通道远大于基板，并且允许基板在整个晶体中自由地扩散。Wyckoff等人。在早期实验蛋白质晶体的性质中，使用流动细胞研究配体的扩散到核糖核酸酶S的0.4mm晶体中。当晶体周围的硫酸铵的浓度快速变化时，晶体内的重新平衡的半级为90秒[2]。

Matthews[3]得到了非常相似的结果，当他使用晶体密度测量来监测硫酸铵溶液扩散到γ-糜胰蛋白酶晶体。根据这些实验可以估计，X-gal大小的分子会在几分钟内通过0.4 mm × 0.4 mm × 0.4 mm的β-半乳糖苷酶晶体。

β-半乳糖苷酶晶体暴露于x -半乳糖中的蓝色，证实了晶体中的酶具有催化活性。它还倾向于表明，但不是证明，催化作用是通过酶的构象发生相对温和的变化进行的，也就是说，没有可能破坏晶体的主要结构变化的迹象。

通过Craig和Co-Workers开发了一种测量单β-半乳糖苷酶分子活性的新方法[4]。该方法取决于弱荧光基材超法β-D-半乳糖苷转化为高荧光产品的超法。使用15分钟的典型孵育，可以用估计的误差测量产物分子的量，从而均β-半乳糖苷酶分子每分钟产生数千产物分子。

利用专门设计的毛细管电泳仪进行了单分子活性测定。这仪器有许多优点。例如，一个蛋白质分子可以与底物反应一段时间，然后从积累的产物移到一个新的位置，允许重复测量相同的蛋白质分子。另一个优点是可以在一次实验中测量多个蛋白质分子的活性。β-半乳糖苷酶分子在结晶前和溶解晶体中都显示出20倍或更高的活性范围。晶体分子的总活性分布为每分钟31,600±1100次反应，而预结晶蛋白的总活性分布为每分钟38,500次反应[5]。

一方面，可以认为催化活性范围反映了个体β-半乳糖苷酶分子氧化或其他此类化学改性。结晶蛋白的活性略低于结晶前测量的蛋白质略低，并且这可能是由于晶体生长期间的另外的化学改性。另一方面，在上述情景中观察到的活动分布不易合理化[5]。可能预期，存在具有相同活动的相对较大的“未脉冲”β-半乳糖苷酶分子，并将存在“受损”分子，然后具有一系列较低的活性。这根本没有观察到这一点。

Shoemaker等。[5]表明，大部分分子（约80％）在11,000反应/分钟和50,000反应/ min之间的活性，而较小的数量（约20％）具有延伸至少100,000个反应的活动/分钟。这些“超重”分子的起源不明显，鞋匠等。[5]断言，一种可能的解释是存在更高的酶的低聚形式。在该评估中，β-半乳糖苷酶八寡发物，例如，具有八个活性位点，仍将计数为单个分子。另一方面，如果某些分子是四聚体和其他八羟肟，则预期这些是给出两个不同的活性值。

β-半乳糖苷酶用氧糖苷键催化与β-二烷吡喃糖苷的反应[6]。它还反应，但具有大量降低的催化效率，用氮气和硫和氟和氟，其是具有其他糖苷键的底物[7]。酶对于D-半乳糖[7]和2,3和4个位置非常特异尤为重要。对于催化反应的酶，这些位置的羟基必须各自存在并以正确的取向。由于2个位置的相互作用而释放的结合能量的分数远大于通过使用氟化和脱氧糖苷的研究[8]所证明的与其他半乳糖基羟基相互作用的级分。

仅当D-葡萄糖是其他反应物时，仅D-半乳糖烷烃，L-阿拉伯吡喃糖烷烃，L-阿拉伯吡喃糖，D-粘合剂和D-半乳酮在反向方向上反应。这通过逆转（反向）β-半乳糖苷酶反应显示[9]在非常高浓度的糖中进行，其取向变化和/或在不同位置处的单独羟基的不存在。酶还水解P-硝基苯基-α-幼叶嘧啶和对硝基苯基-β-D-粘合剂（其没有O6羟基），但这些基材粘合得差并缓慢反应[10]。

因此，在d-半乳糖的C6羟基位置发生修饰的糖仍然是底物，尽管是较差的底物，但其他地方发生变化的糖(d-半乳糖除外)是不反应的。当Glu537与C1反应，同时在C2位置加成质子时，d-半乳糖形成一个相对稳定的共价中间体，这就是它反应[11]的原因。这导致共价键连接的2-脱氧半乳糖的形成，并在水解时释放出来。在高浓度d-半乳糖和葡萄糖的逆反应[9]中，共价实体与葡萄糖反应。

β-半乳糖苷酶是由四个相同的多肽链组成的四聚体，每个肽链由1023个氨基酸[12]组成。在非对称单元中有四个四聚体的单斜晶形式下(图2)，晶体结构初步确定为[13]。随后，结构被细化为一个正交晶体，在不对称单元[14]中有一个四聚体。在随后的结构和功能研究中，后一种形式在技术上更优越，并且一直被使用。在每个单体中，1023个氨基酸形成5个明确的结构域[13,14]。一个所谓的磷酸三糖异构酶(TIM)或α8β8桶是第三个(中心)结构域，活性位点在桶的c端形成深坑(残基334-627)。如下面所述，活性位点的关键元素也由来自同一多肽链其他地方的氨基酸以及来自四聚体内其他链的氨基酸贡献。

研究人员认为β-半乳糖苷酶是由一种更简单的单域TIM桶状酶产生的，该酶具有扩展的活性位点裂解，可以裂解扩展的低聚糖[15]。活性位点裂口的大小与结合双糖底物相称，可能已经减少了后续加入额外的结构域。此外，作为一种诱导剂的异丙乳糖的产生可能是通过这些额外的元素促进的。

发现，在β-半乳糖苷酶的早期研究中发现，缺失在氨基末端附近的某些残基，例如23-31或11-4110，[16]使得四聚酶解离惰性二聚体。

此外，还可以利用含有部分或全部“缺失”残基(如3-41或3-92)[17]的肽段来重建酶的活性四聚体形式。这种“α-互补”现象是用于克隆的常用蓝/白筛选(X-gal)的基础。现在可以用三维结构来解释了。

相邻亚基中约13到20个残基相互接触，如图2[18]所示。一项关于α-供体取代的研究表明Glu17在α-互补中起重要作用。在图的顶部是其他两个子单元之间的等效交互。四聚体解离成二聚体(或“α-受体”)，由于这些残基的去除，削弱了垂直激活界面。同时，形成水平长界面的残基没有改变，并允许蛋白质保持二聚体的状态。二聚体有些不稳定，除硫醇和足够的钠外，容易解离成单体⁺和米格²⁺存在。这些添加剂稳定二聚体结构[19]。

当互补肽（“α-供体”）提供给α-受体时，它在由除去的N-末端残基腾空的位点结合。这将进一步稳定α-供体的结合，并有助于恢复四聚体结构。只要存在N-末端〜41氨基酸残基，α补充肽的长度并不重要。甚至变性的整个野生型酶带来互补[20]。

在上述四聚态和二聚态之间的转变过程中，酶的活性有重要的影响。活性位点包括其他结构域的关键催化残基，尽管它主要由结构域的TIM桶形成。特别是循环域2的单体延伸到激活界面的活性部位为单体D总共有四个这样的交互在激活接口(D, D a, B, C, B和C),形成四个等价活跃网站每四聚物。相反，四聚体分解为二聚体时，所有四个活性位点都被破坏，完全消除酶的活性。

要完全活跃，β-半乳糖苷酶需要na⁺或者K⁺[21]和mg2⁺[22]。对一价和二价阳离子的依赖不是绝对的，因为即使阳离子对结合和反应都很重要，在没有它们的情况下仍有一些残余活性。如图所示，与Na配位的配体⁺或者K⁺是ASP201的羧基，PHE601的PHE601的肽氧和ASN604的侧链氧，在1和3个水之间。此外，重要性也可以是Tyr100与ASP201之间的相互作用。有趣的是，PHE601的苄基的π电子云也成为反应过程中单价阳离子的“配体”。另外，每当基质，过渡状态或共价中间体在活性位点时，半乳糖O6羟基替代其中一个水。

β-半乳糖苷酶似乎是独一无二的，就像这样，在单价离子和羟基之间的相互作用。单价阳离子的功能活动网站的所有其他已知的酶单价金属需求[23],要么帮助中和负电荷的基质磷酸基,经常与二价阳离子,或者他们有结构的重要性,但在这种情况下,Na +与羟基进行交互。

没有完全掩埋，衬底最初在浅模式下在活性位点结合[24]。解离常数Ks与这种相互作用相关联。在基板结合之前和之后，有源部位环和PHE601在衬底结合之前和之后开放，但是当基板绑定时，通过电子密度的封闭形式定义了环和PHE601的开放形式[25]。这表明循环是直到衬底绑定到底部没有完全打开。

在吲哚8上以吲哚8的更小或更小的半乳糖煤氧气，浅模式中的基板占据大致平行于TRP999的位置。在Van Der Waals范围内是TRP999和大多数半乳糖基和葡萄糖基碳之间的距离[27]。在这些情况下，面向吲哚是糖的侧面具有氢而不是羟基。这些氢被认为通过相对侧的羟基通过电子拉动诱导的部分正电荷。这些部分带电的氢与TRP999吲哚的π电子云相互作用。现在可以看出，合成基材的疏水性糖线与TRP999相互作用，并且在前段时间显示强烈粘合[24,28]。

除了与Trp999相互作用外，底物的半乳糖组分的每个羟基在浅位点上都有特定的键。Glu461与C2羟基形成氢键(~ 2.6Å)，而Glu537与C3羟基接近(~ 3.1 Å)形成氢键。Asn460与C3羟基形成间接相互作用(通过水)。底物半乳糖部分的C4羟基与Asp201和活性位点Mg2+连接的水分子相互作用。C6与Phe601的苄基之间存在疏水作用，Asn604与C6羟基相互作用。C6羟基与Na+、[24]和His540[30]均有很强的相互作用。

尽管C3葡萄糖基和半乳糖基环氧之间存在intralacte2.9Å氢键，但除了与TRP999的触点外，没有与乳糖的葡萄糖部分没有比键。ONPG O-NITRO组与TRP999相互作用，但也与HIS418进行了相互作用[24]。然而，在PNPG和HIS418的P-NITRO组之间没有粘合。由于额外的粘合，因此不能访问一些内在结合能量，因为额外的粘合，ONPG比PNPG少得多。该相互作用对半乳糖基化速率有显着影响，并且ONPG反应速率与PNPG速率显着不同[31]。

来自嗜热微生物的β半乳糖苷酶对温度和其他失活剂具有天然的内在稳定性，在食品工业中无论是溶液还是固定化形式都很有用，允许同时进行软热处理和乳糖的低水解[32,33]。嗜热β半乳糖苷酶已被用于乳制品的工业加工和热处理，以灭菌产品，并代表一个非常有用的替代中嗜热酶。与在高温[34]下对这类材料进行酶处理相比，降低微生物污染是工业中普遍公认的优势之一。

冷活性β半乳糖苷酶是一种重要的食品工业酶，是将乳糖水解成其基本成分的酶。从冷活性β半乳糖苷酶中分离得到嗜冷酵母，在低温和酸性条件下以乳糖为唯一碳源生长。革兰氏阳性南极细菌Arthrobacter sp. C2-2含有两个，可能是三个冷活性同工酶β半乳糖苷酶。对C2-2-1同工酶进行了克隆、纯化和表征。Tis β半乳糖苷酶被归类为葡萄糖苷酶[35]家族2的成员。

在生物技术过程中，超声波方法被广泛用于实验室规模的工作，它不需要复杂的设备或广泛的技术培训。超声辐射可以改变生物分子的结构和功能。因此，超声强度的高低对许多酶在超声作用后的活性或不活性起着重要的作用。

从乳酸菌细胞到培养基的释放较高的β半乳糖苷酶活性是超声处理的。然而，只有当β半乳糖苷酶选用时乳糖水解才能增强。远高于常规发酵的那些，与常规程度低于40％的常规程度相比，获得的乳糖水解程度将近75％。当表现出这种工作的发现[36]时，可以同时同时获得高活性细胞计数和高度乳糖水解。

已经发现是使用全细胞作为β半乳糖苷酶来源的乳糖水解的有趣替代方案，但是在使用全细胞中的主要缺点是细胞膜对乳糖的差质性差[37]。渗透技术可以克服这个问题，有助于开发乳糖水解的低成本技术。因此，对于使用酵母细胞生产乳糖水解牛奶，施加渗透技术。在优化条件下，乙醇透氧酵母细胞得到89％的乳乳糖水解[38]。

水解后，乳制品乳清是一种具有高有机化学需求的污染物产品，可用作牛食品资源，并在食品工业中用于开发没有乳糖含量的新产品[39]。乳酪乳清是一种高度污染的产品，由0.7％（w / v）蛋白，5％（w / v）乳糖，93％（w / v）水和盐组成。作为β半乳糖苷酶水解后的微生物细胞培养的便宜易含的底物，可以使用该有机废物[40]。乳清蛋白（例如α乳白蛋白）具有优异的功能性质，其可以通过超滤和水解以产生许多有用的药物中间体。乳酪乳清/渗透物流可以直接使用β半乳糖苷酶，导致高甜度糖浆，可用作冰淇淋，甜点等中的添加剂[41]。

半乳糖苷酶在体内基因传递研究中不是一个好的报告基因。由于在大多数组织中内源活性过多，因此很难区分外源活性。当进行非病毒基因传递时，表达的DNA数量通常很低，以至于你无法压倒内源性活性，因此不能确定地说你检测到的酶活性来自你的新DNA。

荧光素酶在体内的工作要优越得多。首先，你可以确定你检测到的荧光素酶活性是真实的，因为在大多数动物中没有内源性荧光素酶活性。通过生物发光成像，荧光素酶活性可以确定无创，允许重复测量相同的动物。-葡萄糖苷酶需要杀死动物，解剖组织，准备显微镜载玻片，然后进行分析，因此进行时间过程研究需要使用更多的动物。

β -葡萄糖苷酶相对于荧光素酶的唯一优势是识别出表达报告基因的细胞的百分比或确切类型。然而，由于前面描述的内源性活性问题，GFP或其他荧光蛋白可能更合适。当X-Gal被水解时，会形成一种不溶性蓝色染料。随着更多的底物被水解，蓝色的进化加剧，使得在克隆和基因表达的常见应用中，可以通过目测快速筛选蓝/白。使用X-gal底物的B-gal测定对基因表达更敏感(染料沉淀和保持颜色非常好)，然而，X-gal不是定量[42]。

相比之下，ONPG水解演变了一种可溶性的黄色染料。这种颜色的发展是定量的;但是比X-GAL敏感，因为光吸收（420nm）之间的线性关系和衬底浓度小。使用ONPG作为B-GAL基材允许定量测量B-GAL活性（因此促进剂活性）（注意，ONPG本身不能诱导LAC促进器，与X-GAL）不同。

记者的选择在很大程度上取决于你想回答的问题。如果启动子的诱导是相关的，那么荧光素酶或B-gal与X-gal结合最适合其较高的敏感性(例如，应激反应启动子被激活)。X-gal是理想的，因为荧光素酶需要一个特殊的相机和光学过滤器(如凝胶文件系统)，因为它可能被眼睛屏蔽。B-gal+ONPG或荧光素酶将产生报告基因活性的定量测量，如果要测定启动子活性，至少需要分光光度计。

B-GAL是理想的记者，假设要最小化材料成本并且易于易于鉴于大学实验室。另一方面，荧光素酶需要：更昂贵的基材;专业设备;仔细处理材料，以及更多时间（因为筛选必然需要更长，因此降低实验室演示设置的吞吐量）。

生物酶独特的催化活性使其成为掺入生物缀合物的主要候选物以进行特定功能。通过酶促进的反应可用于增强所需化合物的合成，转化基材以产生可检测的信号，从体内肿瘤位点的前药产生活性药物，并水解降解生物分子以产生限定的片段。

为了确定生物流体中的乳糖，可以使用β-加仑，并且它用于食品加工操作，特别是在固定的形式中。通常，酶用作报告酶，用于监测基因活化和转录。

当与抗体分子或链霉抗生物素蛋白缀合时用于ELISA系统的β-GAL也具有良好的特性[43]。由MW 135,000的四个相同亚基组成，每种具有独立活性位点，β-加仑的分子量为540,000 [44]。用螯合的mg.²⁺维持酶活性部位构象所需的离子有二价金属作为辅助因子。增强底物周转是由于NaCl或稀溶液(5%)的低分子量醇(甲醇、乙醇等)的存在造成的。β-半乳糖含有大量巯基并被糖基化。市售的β-gal通常是从大肠杆菌中分离出来的，其最适pH值为7至7.5。

相比之下，哺乳动物β-半乳糖苷酶通常在5.5至6的范围内具有pH值;因此，可以避免在免疫组织化学染色期间来自内源β-GAL的干扰。由于酶的相对高的分子量，与抗体和β-gal形成的缀合物可以比与碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶相关的缀合物。因此，用β-GA1制备的抗体缀合物可能在免疫细胞化学或免疫细胞化学染色技术期间渗透组织结构比用其他酶制备的抗体孔隙。

该酶在ELISA过程中仍然是一个次要的角色，尽管已经有许多研究文章描述了与β-gal结合的抗体的制备和使用。该酶的利用率低于所有商品化ELISA产品的1%。β-Gal可以用SMCC试剂偶联到抗体分子上。为了形成马来酰亚胺活化的衍生物，该交联剂首先通过其胺反应的NHS酯端与抗体反应。这与大多数利用SMCC的抗体-酶偶联方案相反，在这种方案中，酶通常首先被修饰，然后是一个含巯基的抗体偶联。

尽管如此，与这种酶的偶联通常以抗体作为第一个目标分子，从而提高了检测能力，如树状大分子和聚合物，因为β-gal已经包含了大量的自由巯基残基，可以参与偶联马来酰亚胺激活的蛋白。