摘要目的:维生素D由于其非增生性、非血管生成特性(这是乳腺癌、结肠癌、肺癌和前列腺癌的标志)，改变了研究方向，试图找出维生素D缺乏、VDRGP和乳腺癌之间的联系。

方法:无症状，绝经前妇女(20 ~ 40岁)诱导VDR基因多态性。对Fok1和Apa1进行PCR -RFLP检测。补充维生素D前后两次检测血清维生素D水平。

结果:妇女（N-294）最低为20岁，最大年龄为40岁。Shapiro-Wilk正常测试完成了。数据是非参数。还计算了平均值±SD（30.6±6.01）中位数和IQR。中位年龄为30岁，IQR年龄为10.33，维生素D基线的平均值±SD为9.87±7.29和7（6.63），为IQR。Fok1和APA1的基因都普遍存在人口中。p值I. .. 0.58＆0.259表明，在Fok1 PCR和APA1 PCR的基线水平下在维生素D中观察到没有显着平均差异。类似地，Fok1＆APA1 RFLP在基线水平下的维生素D的平均值没有统计学显着差异;p值分别为0.759和0.44。

结论:VDR基因型差异很大。folk1和Apa1基因分布均匀。重要的观察是Apa1中没有纯合子组。与其他研究相比，Fok1和Apa1与维生素D缺乏没有显著相关性，这表明VDR基因多态性与乳腺癌没有显著相关性。

多态性，异源二聚体，外显子，内含子，骨化三醇，细胞凋亡，血管生成，单核苷酸多态性，电泳。

摘要目的:维生素D由于其非增生性、非血管生成特性(这是乳腺癌、结肠癌、肺癌和前列腺癌的标志)，改变了研究方向，试图找出维生素D缺乏、VDRGP和乳腺癌之间的联系。

方法:无症状，绝经前妇女(20 ~ 40岁)诱导VDR基因多态性。对Fok1和Apa1进行PCR -RFLP检测。补充维生素D前后两次检测血清维生素D水平。

结果:妇女（N-294）最低为20岁，最大年龄为40岁。Shapiro-Wilk正常测试完成了。数据是非参数。还计算了平均值±SD（30.6±6.01）中位数和IQR。中位年龄为30岁，IQR年龄为10.33，维生素D基线的平均值±SD为9.87±7.29和7（6.63），为IQR。Fok1和APA1的基因都普遍存在人口中。p值I. .. 0.58＆0.259表明，在Fok1 PCR和APA1 PCR的基线水平下在维生素D中观察到没有显着平均差异。类似地，Fok1＆APA1 RFLP在基线水平下的维生素D的平均值没有统计学显着差异;p值分别为0.759和0.44。

结论:VDR基因型差异很大。folk1和Apa1基因分布均匀。重要的观察是Apa1中没有纯合子组。与其他研究相比，Fok1和Apa1与维生素D缺乏没有显著相关性，这表明VDR基因多态性与乳腺癌没有显著相关性。

多态性，异源二聚体，外显子，内含子，骨化三醇，细胞凋亡，血管生成，单核苷酸多态性，电泳。

在包括巴基斯坦在内的亚洲国家，乳腺癌发病率的上升令人担忧。巴基斯坦的乳腺癌发病率是亚洲其他国家的2.5倍。10万巴基斯坦妇女中有50人患乳腺癌，而印度妇女中有19人患乳腺癌。据说，每九名女性中就有一人可能被诊断为乳腺癌，而且这个比例随着年龄的增长而增加。

在美国，乳腺癌引起了不小的轰动，发病率和死亡率的上升使研究转向了预防而不是早期发现。排在首位的是可改变的风险因素，如维生素D和乳腺密度，两者都与降低乳腺癌风险有关。

在巴基斯坦，据报道维生素D缺乏率在89%-92%之间[4-5]，这是相当令人担忧的，因为这个国家阳光充足。

将维生素D与乳腺癌联系起来的初步观察来自生态学研究[6]。由于紫外线B（UVB）光线对于维生素D的皮肤生产是必不可少的，因此对于最佳维生素D水平，阳光暴露是强制性的。

生态学研究有相关的阳光暴露，低乳腺癌发病率和死亡率[7-10]。上述研究为检查维生素D缺乏症的假设提高了癌症风险和死亡率，包括乳腺癌的假设。观察到这项协会的这种兴趣，最近的一些观察性研究以及维生素D补充的临床试验，这检查了维生素D状态和乳腺癌之间的关系。维生素D缺乏通常定义为血清25-羟基维生素D（25（OH）D）小于20ng / ml或50nmol / L（1ng / ml = 2.5nmol / L）。这已成为医生之间的共同关切，其中许多人现在常规筛选维生素D缺乏和/或建议在健康妇女和乳腺癌患者中补充。健康个体的上部安全限制从2000 IU筹集到4000 IU每天。然而，IOM还提出了对循环25（OH）D水平以上50ng / ml（或125nmol / L）的负健康效应的担忧。

在对文献进行全面回顾后，我们得出结论，没有足够的证据推荐维生素D补充剂作为癌症预防或治疗的替代和维持(http:// www.IOM.edu/ vitaminD)。

观察了维生素D、VDR和VDR基因多态性在不同种族中的抗癌特性，并评估了其与乳腺癌的关系。

维生素D通过与维生素D受体(VDR)结合来实现，VDR是一种有效的转录因子，但依赖于配体。该受体具有两个锌指结构，一个是dna结合结构域，另一个是羧基末端配体结合结构域[11]。当绑定到它的配体,骨化三醇(1,25 (OH) 2 D), VDR二聚类维生素a的X受体(RXR),发生构象变化,使异质二聚体可能促使进入细胞核,它结合维生素D反应元件(VDRE)启动子区域,负责目标基因的转录调控。VDR的重要功能包括凋亡、细胞增殖、分化、血管生成和转移[12]。

人体维生素D缺乏或VDR功能障碍的主要影响可能导致骨骼发育和健康不良，并增加许多慢性疾病的风险，包括癌症[13]。维生素D在人体中的非骨效应是由其受体VDR介导的。这种核受体受到多种遗传多态性的影响[14-15]。VDR基因位于染色体12q12-q14上，包含8个蛋白编码外显子(2-9外显子)和1个未翻译外显子(1a- 1f外显子)[16-17]。通过不同的限制性内切酶筛选，只能分析VDR基因的部分限制性区域，验证DNA序列变异[18]。VDR多态性中经常被研究的基因有位于VDR外显子2的Fok1，位于VDR内含子8的BsmI和ApaI，以及位于VDR[16]外显子9的TaqI。这些是单核苷酸多态性(SNPs)，其中FokI位于VDR基因的5 '端，其他三个SNPs位于基因的3 '端[14,17]。我们调查了Fok1和Apa 1这两个基因的存在，并研究了它们在我们人群中的存在。

研究参与者:从2013年6月至2014年6月，从巴基斯坦卡拉奇帕特尔医院的乳房诊所引入20至40岁、无症状和绝经前的妇女作为研究参与者。所有的参与者都进行了血清维生素D水平的测量，并保存了泛白涂层用于DNA提取，然后通过PCR和限制性片段长度多态性(RFLP)进行DNA扩增。

所有有乳腺癌史、乳房手术史、怀孕或哺乳期、绝经状态不明及口服避孕药的女性均被排除在外。该研究由齐亚乌丁大学医院的机构审查委员会批准。获得书面和知情同意。

血清25（OH）D分析：取患者肘正中静脉血清，用化学发光免疫法检测血清25 (OH) D。

Holick的协议:每周50,000天内的维生素D3为参与者提供8周的时间，以补充缺陷的维生素D.在维持阶段50,000型IU维生素D3每2周给药。在6个月的治疗后测量血清25（OH D）;如果水平超过30ng / ml，则提供了维持治疗[19]。

研究参与者的人体测量数据、初潮年龄、胎次、怀孕次数、孩子数量、第一次生育年龄和母乳喂养史由一位受过培训的医生以结构化的格式进行询问和记录。

DNA提取:研究参与者的静脉血用10ml EDTA管采集。采用pure link Tm基因组DNA迷你试剂盒从采集的血液中提取基因组DNA。k1820-01)。(编号1398040)。DNA保存在-80°C。

聚合酶链反应:利用Apa1和Fok1酶切扩增的DNA片段，确定VDR基因2SNPs的基因型。使用热循环仪提取DNA (PCR条件为:940°C初始变性5分钟，940°C 30秒，600°C 30秒，720°C 5分钟，最终延伸)。这样做是为了扩增VDR基因。扩增外显子2以研究Fok1多态性，扩增外显子9以研究Apa1多态性。基因组DNA是放大使用特定的引物(Apa1,底漆1 - 5“-CAGAGCATGGACAGGGAGCAA-3”),霍英东1引物(5 'agctggccctggcactgactctgctct-3”)的工作解决方案的PCR反应的外显子2和9是用最终体积的混合25μL 5μg的基因组DNA被添加到最终的混合。

限制性片段长度多态性:在特定的时间和温度条件下，用特定的酶对扩增片段进行消化，以评估研究中使用的每个参与者的基因型。研究了两个VDR基因多态性:Fok1 (rs10735810 T>C)和Apa1 (rs7975232 G>T)。扩增片段分别使用Fok1和Apa1酶。取PCR产物10 μL，加入含4个Fok1单位的5 μL酶切，在37ºC恒温培养箱中消化16小时。用Fok1酶切VDR外显子2后，可以区分出3个基因型:纯合野生型FF、纯合FF和杂合FF基因型。经酶切得到的纯合子ff基因型产生了2个片段(70和197 bp)，而ff基因型由于没有酶切，产生了一个单独的片段(267 bp)。Ff杂合子基因型产生3个片段(70、197和267 bp)。为研究Apa1多态性，采用VDR第9外显子的PCR扩增产物。对于Apa1多态性，在PCR产物中加入含有5个单位ApaI酶的5 μL混合物。Apa1在25ºC的温度条件下消化16小时，产生三种不同的基因型。 The homozygous aa genotype produced 2 fragments (217 and 528 bp), and homozygous AA genotype produced 1 fragment (745 bp). Heterozygous Aa genotype produced 3 distinct fragments (217, 528 and 745 bp).

电泳：为了研究PCR扩增和酶切，我们进行了电泳;本技术用于验证DNA片段在2%琼脂糖凝胶中的迁移，并用绿色安全缓冲液(1 μL/ mL) (NZY tech Lda)进行染色。葡萄牙里斯本)。酶解电泳:制备3%琼脂糖凝胶，酶解产物总积载于凝胶中。使用分子量标记100 bp Plus DNA Ladder比较DNA片段的分子量。琼脂糖凝胶可视化使用紫外线Hero Lab。

数据采用SPSS(社会科学统计软件)20版进行分析。夏皮罗-威尔克正态性检验应用于整个数据，以检验正态性假设。拒绝数据正态性假设，即数据不是正态分布，因为p值小于0.05。

定量变量如年龄、维生素D水平基线，由于违反了正态假设，采用中位数和IQR代替均值±SD来表示。

计算Spearman相关系数(显著性水平= 0.05)以确定定量变量之间的相关性。

该研究于2013年6月至2014年6月进行。350名年龄在20到40岁之间的女性被招募到这项研究中。其中，235名女性接受了调查，VDR基因多态性fok1和Apa1的参与人数分别为154人和152人。所有患者均为维生素D缺乏症(表1)。年龄在20 - 40岁之间，由于所有患者均为维生素D缺乏症，因此考虑年龄组别，因为年轻女性更活跃，更多地暴露于外部环境。

在这种情况下，阳光是最能自然增加维生素D水平的外部因素。这个年龄段的人也更关心他们的饮食，如果已婚和母乳喂养，他们有一个额外的优势，在这个过程中看医生，必须指导他们的维生素D水平。

维生素D补充的响应是显着的（图1）。水平从缺陷增加（表1）增加到足够（图1）。Wilcoxon签名等级测试是为了评估基线和12个月的维生素D水平之间的差异。从9.87至68.3的基线增加了显着增加（表1）。这表明患者对维生素D的补充有P值<0.001（图1）。

患者填写的Proforma包含了所有的人体测量数据，并根据我们数据中的不同参数计算了患者年龄的Spearman相关系数(表2)。我们发现，只有基线时维生素D水平与患者年龄显著相关。基线时维生素D水平较低，且与患者年龄呈弱正相关，r值为0.181 (p<0.05)。这也给我们带来了维生素D水平的弱相关性;数据表明，随着患者年龄的增加，维生素D水平也会增加，但这是一个微弱的相关性。

与维生素D受体相关的基因是多种多样的和两个测试在我们的人口Fok1 Apa1and记录(154年52.4%)和(152年51.7%)(图2)。一旦基因分别证实,VDRGP完成和野生型纯合子和杂合的过程中研究了RFLP(图3)。

Fok1和Apa1这两个基因仅在基线时与维生素D相关(表3)，由于资源短缺，无法在足够的维生素D水平下重复，结果不显著。一旦基因存在，可能就会发生多态性的变化。

Fok1 PCR和Apa1 PCR在基线水平的维生素D差异均无统计学意义。同样，Fok1 RFLP和Apa1 RFLP三种不同多态性对基线水平维生素D均值的影响无统计学意义。p值分别为0.759和0.44(表3)。

VDR基因多态性表现为纯合子组占优势，Fok1为46.7%，Apa1为71.7%，杂合子组在Apa1的所有多态性中最高。因为我们的回顾性分析显示了很多种族差异在形式表中有一个种族栏，所以我们可以将不同的种族联系起来，但这将在另一项研究中使用。有趣而重要的观察是，在fok1中观察到的纯合子组最高，而在Apa1中却没有(图3)。fok1和Apa1的多态性之间存在显著关联，p值<0.001(图4)。

乳腺癌如何以及为什么会发生是一个价值百万美元的问题，这导致了有关疾病预防的机会有限。这使研究的方向转向了预防而不是早期发现。有些因素是不能被修饰的，如遗传因素、分子信号通路和环境因素，但有些因素是可以被修饰的。一旦与这种疾病相关的可改变的风险因素被识别出来只有这样我们才能准确监测和预防乳腺癌这又是一个问号。考虑到这一点，我们的任务是调查两个对乳腺癌非常重要的因素，维生素D水平和VDR基因多态性及其与乳腺癌[20]的相关性。

维生素D是可改变的危险因素之一，对某些癌症也有保护作用，有一致的流行病学证据表明，增加维生素D摄入与降低结直肠癌[21]和乳腺癌[22]的风险有关。这种维生素的水平从未以我们期望看到的其他维生素的方式接近。与其他维生素不同的是，我们从来没有把维生素D的膳食摄入量作为一个合理的参考点，来决定人们应该摄入多少这种维生素。

与其他第三世界国家一样，巴基斯坦缺乏这种维生素的情况相当严重。维生素D水平影响乳腺癌发生或存活的确切时间段目前尚不清楚。因此，诊断、治疗和预防维生素D缺乏是最理想的方法。研究人员进行了大量的比较，并收集了具有统计学意义的交互作用，表明阳光照射和维生素D对基因易感的女性可能是最重要的，而且乳房组织更容易受到侮辱。随着越来越多的研究证实了类似的结果，膳食维生素D和充足的阳光照射将是乳腺癌患者可改变的风险因素之一，即，通过提高维生素D水平，他们可以预防这种病态的[24]。

我们的研究参与者为20-40岁的女性，维生素D的范围小于20ng/ml。在巴基斯坦卡拉奇进行的横断面多中心研究显示，维生素D不足主要是由于摄入不足和避免阳光。结果表明，发病群体中女性多于男性，维生素D缺乏范围为[24]。

其他重要因素是VDR及其基因多态性。对VDR基因多态性前瞻性研究进行的荟萃分析发现Fok1和APA1基因之间的关联[20]。FF与乳腺癌FF基因型之间存在一些关联[25]。在我们的参与者中，民间1和APA1基因的平等分布。在多态性中，我们在Fok 1中看到了三组;野生型，杂合和纯合。主要的是纯合变种。另一方面，APA1基因中只有两个VDR的变体I.。野生型和杂合变体和主要的一种是杂合的。

与其他研究相比，Fok 1和Apa 1与维生素D缺乏无显著相关性，由此得出VDR基因多态性与乳腺癌无显著相关性的结论。

VDRGP与Fok1基因乳腺癌风险:在关于fok1的7项研究中没有发现关联。在Apa 1中，只有两项由95%白种人组成的研究表明Apa 1与乳腺癌风险之间没有显著关联。引起乳腺癌的原因尚不清楚，因此限制了预防疾病的机会。因此，对乳腺癌病因学进行深入研究显得尤为重要。只有通过识别与这种疾病相关的可改变的危险因素，才能实现有效的乳腺癌预防。

对于某些癌症的可修改危险因素之一是维生素D [26]。Fok1多态性显示出与乳腺癌风险的关联，并且在混合种族中没有与BSM1，Taq1和APA1多态性和乳腺癌风险之间的关联。众所周知，VDR基因型因种族而异，Fok1，APA1和BSM1多态性和乳腺癌风险之间没有明确的关联[27]。

在我们的研究中，folk1和Apa1基因的分布是相同的。VDRGP的另一个有趣的方面是，在Fok1中纯合子组占优势，而在Apa1中则不存在，也像其他研究一样，Fok1和Apa1与维生素D缺乏没有显著相关性。由此我们得出结论，VDR基因多态性与乳腺癌风险无显著相关性[28-29]。

总之，我们想评论目前的研究提供了VDR多态性（Fok1和APA1）与一般人群中乳腺癌风险无关的证据。进一步的研究是澄清这些结果的必要条件。

作者称没有利益冲突。

感谢Ambreen Wasim小姐在统计分析方面的帮助，感谢Shamim Mushtaq博士在实验室的技术支持。

该研究得到了Ziauddin大学和Patel医院的机构审查委员会批准。书面知情同意书获取从研究中招聘之前的所有研究参与者获得，并在整个研究中维持了数据的匿名和保密性。