加密保护最常用保存人精法 导致精子运动性显著下降在此,我们尝试引进新方法不冻地存储精子液态保留精子中添加不同浓度genistein补充精子总抗氧化能力(T-AOC)、deptione(GSH)、甲烷二叉状 aldehyde(MDA)、acrosomal酶活动以及精子受精能力液存储和密码保护对精子参数的影响也比较IVF介质辅助Genistein20molL-1保持精子运动达11天Genistein增法导致反应式氧子生成量下降,显示精子运动性得到有效提高,并减少MDA生成量并维护GSH内容并增强精子液存储期间氧化性应容能力存储精子用于向人类子细胞注入内托盘精子并成功激活子细胞寄存液介液优于寄存液氮,从抗氧化应力和受精能力看Genistein可用作液态精子存储的抗氧化剂sperm存储于IVF介质和Genistein可避免隐蔽损坏,这可能成为辅助复制技术的替代选择

抗氧化物辅助生殖技术、ROS、Sperm运动性、Sperm保存

加密保护最常用保存人精法 导致精子运动性显著下降在此,我们尝试引进新方法不冻地存储精子液态保留精子中添加不同浓度genistein补充精子总抗氧化能力(T-AOC)、deptione(GSH)、甲烷二叉状 aldehyde(MDA)、acrosomal酶活动以及精子受精能力液存储和密码保护对精子参数的影响也比较IVF介质辅助Genistein20molL-1保持精子运动达11天Genistein增法导致反应式氧子生成量下降,显示精子运动性得到有效提高,并减少MDA生成量并维护GSH内容并增强精子液存储期间氧化性应容能力存储精子用于向人类子细胞注入内托盘精子并成功激活子细胞寄存液介液优于寄存液氮,从抗氧化应力和受精能力看Genistein可用作液态精子存储的抗氧化剂sperm存储于IVF介质和Genistein可避免隐蔽损坏,这可能成为辅助复制技术的替代选择

抗氧化物辅助生殖技术、ROS、Sperm运动性、Sperm保存

保护人体精子在许多领域展开,例如安卓实验室和辅助复制中心人类精子加密显示管理雄性不孕[1]的宝贵治疗方法精子在密码保护期间接触化学和物理压力时,会给精子运动性、可行性和不良状态带来许多不利影响[2-6]保护密码后,所有这些效果将削弱人工精子7的受精能力需要替代方法消除精子密码保护的负面影响

动物用多种方法不冻地保护精子,如糖盐保护法和蒸发干燥法[8-10]人工精子试图存储缓冲中,内含蛋黄、Tris和TES,不冷达96h[11-13]精子存储缓冲24H[13]快速下降据报道,精子染色体保存后评价时结构变化频率增加[14,15]因此,这一介质中的存储被认为大多无效[16,17]

精子保存期间,反应式氧物种的出现将导致氧化性压力[18]ROS对精子的损害导致脂重过氧化,由精子PUFAs(分片多饱和脂肪酸)的氧化性损害[1920]引起脂过氧化产生各种影响,如精子机能下降、精子脱氧核糖核酸不可逆转变化和细胞内酶渗漏[21]并影响精子渗透并预防精子细胞聚合因此,ROS生成量需要减少

Genistein是一个来自大豆或其他豆类的IsoftlaGenistein抑制蛋白调频并显示雌激素活性修改成熟精子电容反射过程因此它会影响许多功能参数 成熟精子此外,Genistein抗氧化能力在体外和Vivo都得到了广泛研究[24,25]Genistein还可以通过抗氧化性活动保护精子DNA完整性

在这次研究中,我们调查了液存储中添加genistein对精子运动性、T-AOC、GSH、MDA、acrosomal酶活动以及精子受精能力的影响我们比较液态精子存储法和传统密码保护法 并发现新法免冻精子保存使用这一基本信息,有可能减少精子受损并改进ART保存过程

本研究经中国山东青岛大学附属Yuhuangding医院机构道德审查委员会批准所有男人在开始研究前都表示书面知情同意所有精液样本均通过自慰从病人中提取,后者来分析精液病人2至7天禁欲性活动样本收集进消毒容器中并在室温下液化样本评估体积、pH值、精子浓度、精子运动百分比、正常形态百分比,这些分析均符合世界卫生组织准则[27]

简言之,当精液样本完成液化反应时,全精液在梯度介质上松散,梯度介质为1.5ml-90%梯度介质和1.5ml-45%梯度介质后列在300xg上离心20分室温度离心处理后,粒子精子重新悬浮2ml清洗介质,该介质类似于存储用介质精子在500xg再离心10分钟上层分离并添加存储介质以最终浓缩30-40x106精子/毫升后划分成1.5ml插管,悬浮/管合0.5ml精子,密封矿油并储存24-26oC数天

Sperm保存在四种不同媒体中,包括IVF (10136,Vitrolife,Service,Service)、humanTubal流水介质(MR-070-D,Sigma,USA)、FM(K-SIFM-100,Cook,Australia)和PBS(Sers,中国)。Genistein从Sigma化工公司(G-6649,USA)购买并溶入DISO股票解决方案划分为aliquts储量解决方案冲淡到工作解决方案使用时介质密码保护精子法如下:精液在500xg离心10分元素等离子分离并加等量低温保护器(ORIGIO,丹麦)和混合井之后,混合添加到1.5ml精密加密管中,并平衡室温10min并喷除液氮30分终于注入液氮存储

sperm运动由计算机辅助精子分析器系统分析5微升悬浮精子贴上预装显微镜滑动带22毫米2覆盖以相向显微镜观察滑动为200x放大十大视图域评价并计为最小千精子/样本VAP < 10ms-

sperm样本与先前报告时相同[28]并作修改简言之,0.1ml精子悬浮置离心机管并离心机800xg达15分取出超生精粒2+/Mg2+免费PBS两次清洗释放细胞内内容时,细胞分三次液氮快速冷却循环破解后,在37摄氏度解析取出细胞悬浮7000xg10分钟清除膜片段,超级目录存储到-80oC直到分析

细胞内GSH内容使用修改并发光学测试系统[29]判定系统drobenoic酸5-5-diobis-2-nitrobenoicDTNB氧化时生成2-Nitro-5thiobeneic稀释多谷素(GSH)内容按标准曲线计算

T-AOC用商业包使用酶法测量(江城技术公司南京市)。T-AOC确定过程遵循操作手册sperm800xg离心机10分钟室温获取超能超级目录回收器使用前存储时间为-80摄氏度简言之,千微值试样1100微值样本、2000微值试样2和500微值试样3用于反应控制管装有试样1号试剂2号和试剂3号,不添加样本采样管和控制管用37摄氏度30分水池后向管添加100ml试剂4,向控制管添加100ml样本最后一次吸收取自孵化周期结束时(混合后10分钟)。吸收值测量值520nm本分析依赖样本中抗氧化剂将FE3+-TPTZ减为FE2+-TPTZ的能力采样管吸收值通过控制管吸收值校正

MDA使用合成法用商业包测量(江城技术公司南京市)。判定MDA遵循操作手册sperm800xg离心机10分钟室温获取超能超级目录回收器使用前存储于-80摄氏度简言之,100ml试剂1、100ml采样、3000ml试剂2和100ml试剂3用于反应控制管内有试剂1号试剂2号试剂3号和乙醇管口密布塑料膜 顶部穿孔采样管和控制管在95摄氏度时取水槽40分钟,然后在800xg离心机10分钟获取超导体532nm测量超强吸收值取决于MDA与TBA的反应,TBA化学绑定成另一种红色物质红色物质532nm最大吸附峰值采样管吸收值通过控制管吸收值校正

acrosomal酶活动用定量测试包测量(华关医学公司,中国深圳市)。甘地经修改法检测精子反转酶活动并遵循操作手册装有7.5x106精子的培养介质8000xg5分钟离心取管底部粒子超目录丢弃后,100微粒抑制器加插管并混合井1000ml反应缓冲和100ml停止缓冲添加到控制管中,但样本管中只添加反应缓冲采样管和控制管用37摄氏度30分水浴,再加到采样管上100微升悬停缓冲4000xg离心机5分钟获取超级目录410nm测量超强吸收值本分析依赖arginineamicas与硝胺线的反射,化学绑定形成另一种有色物质采样管吸收值通过控制管吸收值校正值计算如下:(样本OD控件OD)xx106/247.5x7.5

MII级单片从IM级单片中采集,由ICSI病人丢弃,ICSI介质中培养20-24h体外精通快速运动和正常形态选择注入注入后,ocytes转介GI介质(10128,Vitrolife,Service)并在37.0摄氏度培养微推1720分弱细胞二极机体二大开发3天对培养型胚胎评分,7-9均匀分片球和小于20%分片率都被视为高质量胚胎Embryos转至GII介质(10132,Vitrolife,Service第5和第6天,只有带放大波科氏洞度、清晰可见内部细胞块数和紧凑轮廓细胞才被视为可用波科氏

每种处理方法至少有三次复制百分数变换并用ANOVA分析时,每度量包含两个以上组或独立测试时,每度量只有两个组邓肯多重比较测试用于查找差分软件使用社会科学统计包SPSS公司,美国IL芝加哥数据表示平均++SEM和P<0.05被认为意义

sperm运动性快速下降,当存储为非洗精子时(图1A),第5天平均精子运动性小于1%等离子值比大于50%时精子运动率比无精子等离子值快速下降(p < 0.05)。无洗精子存储导致精子快速退化不适合精子存储

HTF和PBS介质存储精子比IVF和FM介质存储精子快速下降3天时,储入调频介质精子的运动性开始快速下降,约下降50%精子用IVF介质保值比FM介质存储精子保值长储入IVF和FM介质5天的平均运动性分别为44.3+7.0%和21.7+5.9%(p<0.05)约2倍流频介质维护优于调频介质维护精子总存储在IVF介质中

Genistein添加二维维维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特维特精子处理率比非精子处理率低(图2,P<0.05)。发现加百度组(10m)和加百度组之间没有差分genistein组(20微米)保持精子运动性优于genistein组(50微米)。两组差别在7天存储后具有统计意义(图2,P<0.05)。7天平均运动率分别为61.0+3.6%和42.0+4.0%

T-AOC和GSH逐步下降,但加Genistein可能会延迟下降自第5天起Genistein补充可维护GSH,远高于非加组数(图3A,P<0.05)。九天两组变化也大不相同(图3A图3BP<0.05)。MDA逐步增加,但加Genistein可能会延迟增加日间9组之间有显著差别(图3C,P<0.05)。GSH和T-AOC也大幅减少,MDA在液氮中精子保存后大幅增加(图4A-C,P<0.05),显示精子抗氧化压力能力显著下降结果表明液态存储不足5天的精子抗氧化压力能力应高于液态氮存储后的精子能力

自第5天起,精子acrosomal酶活动通过添加genistein得到维护,该增量远高于非加组数(图3D,P<0.05)。九大类精子反转酶活动分别为90.7.2.3mlU和52.3.4.3mlIU(p<0.05)约2倍acrosomal酶活性从180.3+4.7mlU下降至123.2+5.7mlIU结果表明添加genistein可能是一种最优方法 来保持精子的Acrosomal酶活动

sperm存储于IVF介质中,加Genistein(20mm)数日不等,然后用于ICSI编入人类子细胞评估其参与辅助肥化和胚胎开发能力(表1)。新鲜精子注入控制精子肥速率相似,但精子储存在IVF介质中,而9天精子耗值极低时不加Genistein胚胎裂变率在所有组间没有差别高质量胚胎和爆破式精子编组而不增加九天Genistein比其他组别低得多结果表明Genistein第5天加法精子受精能力类似于新精子精子存储液氮后,受精能力与精子相似,第5天不添加genistein总体结果显示,静脉注射F介质与Genistein保数日功能性辅助肥化

研究显示 人类精子与Genistein使用IVF介质可保持精子多功能数日与传统隐蔽法相比,这种方法短期内可保持精子运动和抗氧化压力能力这可能是保存精子的替代方法

当前精子加密是唯一存储人精子的方法,但这一常用方法导致精子运动性显著下降[30]密码保护可导致精子脱氧核糖核酸损害,并可能带来隐性效果,如细胞内酶活动风格改变和失序等离子膜不可检测精子脱氧核糖核酸损害会降低生殖结果,如对肥速率和植树前发育产生不良效应还可致孕和发病[33]保留精子脱氧核糖核酸完整性非常重要 以右传染色素素成功辅助复制需要开发比密码保护更好的方法维护精子脱氧核糖核酸

sperm存储非洗刷可能是最简单方法免冻保存,但精子运动在第一天迅速失利半等离子体中可能有损精子[34]半粒子有可能保护精子免脱氧聚合物多发性酶损害,但也会大大降低精子对含菌和列科西特斯的可行性精子等离子还含有核素,这些核素损耗精子膜,因为它能输入精子脱氧核糖核酸[35,36]

研究中,HTF和PBS媒体保存精子快速质量损失三天存储后精子运动性在除IVF介质外的大多数介质中迅速下降对比四种不同介质时,IVF介质是精子存储中最优介质,可保持精子质量井据报道精子运动率在HTF存储后数日内下降至10%[37]已经对脱氧核糖核酸损害源进行了大量研究[38]最近证明精子运动性可保持足够长的时间以参加活体肥化,因为存在求生存因素。亲生存因素可防止精子进入偏差状态[39]亲生存因素可能存在于IVF介质中,而不是其他介质中,可以防止精子进入optic路径或至少减慢速度简单介质不包含求生存因素 可能方便精子进入偏差路径

反应式氧物种直接造成精子DNA损害[40]结果表明ROS损耗精子核和mitocordria,这些精子核与保持精子机能和肥化能力相容[41]精子和外生化物代谢过程产生ROS,破坏精子生物系统密码保护期间证明精膜脂过氧化可能因ROS发布[42]而增加Sperm特别容易受ROS诱发损害,因为它们含有大量PUFA内容。因此,有必要添加抗氧化剂以减少ROS对精子的影响[43]

防御机制与ROS生成间变异平衡与精子电容过程相关[44]Sperm机能化和电容化与蛋白白化相关阻抗暴动因子变换精子功用参数[45]Genistein抑制强效树脂 以依赖剂量方式影响精子运动低浓度genistein不干扰小鼠和人精子运动性,但高剂量对精子运动性有负作用,并显示精子运动性随加400mol/Lgenistein[45-47]而下降精液存储介质添加20mol/LgenisteinGenistein加法减少了精液存储期间生成的ROS值,这些数据显示Genistein使用该富集度(20mol/L)可为精子提供抗氧化特性我们猜想它与抑制暴风素和电容过程相关[45]

上个实验中 稀疏谷地内添加到介质 提高可生存精子百分比液存储期间,增氧化应激作用与ROS负作用相关联GRD活动下降和SPD活动导致GSH内容下降和超氧化阴离子增加GSH氧化还因过氧化氢而增加ROS增产和细胞内GSH下降流水存储导致精子运动性下降液存储中添加外源genistein可预防ROS诱发损害并维护精子功能结果表明低剂量基因处理可提高小鼠血清睾固酮水平并规范精子生成相关基因表达方式ESR2表示式CYP19A1、SOX9和BRD7Estrogen接收器(ESR2)调试Estrogen效果[49]CYP19A1基因在雌性生物合成中发挥重要作用SOX9是生物细胞生存和扩散不可或缺的调节器 [52]Genistein与雌激素受体交互作用并产生重要的雌激素效果[53-55]因此,我们推测Genistein通过规范某些基因表达方式来发挥精子作用

液态精子存储法可应用到以下类型:第一,防冻性差精子在冷冻前有正常运动性,但在密码保护后病人精子质量显著下降精子结构函数中 有一些或多方面有病理变化这些先天缺陷可能使精子易冻性损坏,导致冷性性能差第二,低质量精子指一组病态精子样本,附异常精子例程参数或低精子基本功能,如稀有精子、弱精和异常精子低质量精子有更差防冻性能 精子函数变化可能有更大效果第三,难手淫的病人不需要长期精子存储器,液体存储法可能更合适

简言之,我们已经显示Isoflavonegenistein加进液存储精子介质时有抗氧化特性Genistein降低ROS产量并增加精子运动性短期存储方式可能是储存人精不冻的最佳方式这种方法可为后续辅助肥化提供高质量保留精子,并可能成为ART基本方法

广中桥刘小燕:学习设计、研究思想概念和手稿编译怀余连灵刘:实验和资料收集优异莉莉陈和吕平张数据分析上文提到的所有作者都彻底阅读并核准手稿

山东自然科学基金会(ZR2016HL08)和Yuhuangding医院基金会(201518)支持这项研究。

作者没有报告潜在兴趣配置