期刊名称:药物开发与输送杂志
文章类型:研究
收到日期:2018年12月13日
接受日期:2018年12月21日
发表日期:2018年12月28日
引用:Pavani B, Harshavardhan B, Sindhu Priya G, Sharanya K, Kanchan (2018) uv分光光度法测定波生坦的方法开发与验证。J Drug Dev Del Vol: 1, Issu: 1(34-38)。
版权:©2018 Pavani B.这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名许可协议的条款发布，该协议允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。
摘要
建立了一种新颖、安全、灵敏、简便的紫外分光光度法测定波生坦原料药和制剂中波生坦的方法。方法已经开发和验证，使用0.1N氢氧化钠261nm稀释剂。所有参数均根据ICH准则进行验证，波生坦在4-20 μg /ml范围内呈线性关系(r2=0.999)，与药品说明书要求吻合较好。
关键字
分光光度法ICH波生坦氢氧化钠
摘要
建立了一种新颖、安全、灵敏、简便的紫外分光光度法测定波生坦原料药和制剂中波生坦的方法。方法已经开发和验证，使用0.1N氢氧化钠261nm稀释剂。所有参数均根据ICH准则进行验证，波生坦在4-20 μg /ml范围内呈线性关系(r2=0.999)，与药品说明书要求吻合较好。
关键字
分光光度法ICH波生坦氢氧化钠
介绍
紫外分光光度法法
紫外-可见分光光度法是药物分析中最常用的方法之一。这种方法包括测量溶液形式的药物吸收的紫外可见辐射量。仪器测量两种光在紫外可见区域的强度之比。
在定性分析中，药物大多是有机化合物，如果有任何先前记录的数据可用于同一化合物，可通过分光光度计进行鉴别。在定量分析中，通过研究化合物的吸收辐射来测定化合物的量。紫外-可见分光光度法简便、快速、专属性强，适用于微量化合物[1]。
定量分光光度分析的基本定律是比尔-朗伯定律:当光束通过含有吸收物质的溶液的透明电池时，用比尔-朗伯定律数学地计算出光强的减弱，它表示为:
一个=美国广播公司
式中，A=吸光度，A=吸光度，b=路径长度，c=溶液中溶质浓度
紫外-可见分光光度计对药用化合物的定量可以通过在透明溶剂中配制溶液，并在合适波长下测定其吸光度来实现[2-4]。通常选择的波长为最大吸收波长(lamda max)。用于分光光度计测定多组分样品中的物质;以下方法正在被使用，
- 同时估算方法
- 导数分光光度法测定
- 吸光度比值法
- 不同的分光光度法
- 溶剂萃取法
药物的介绍
应用波生坦:波生坦是一种双内皮素受体拮抗剂，在治疗肺动脉高压(PAH)中发挥重要作用。它在美国、欧盟和其他国家被Actelion Pharmaceuticals以商标名Tracleer®授权用于PAH的管理。波生坦通过阻断内皮素分子的作用来治疗肺动脉高压，否则内皮素分子会促进血管变窄而导致高血压[5,6]。
内皮素-1 (ET-1)是一种神经激素，其作用是通过与ET结合介导的一个和等B内皮细胞和血管平滑肌中的受体。肺动脉高压患者血浆和肺组织中ET-1浓度升高，提示ET-1在本病中的致病作用[7]。波生坦是一种特异性和竞争性的内皮素受体拮抗剂一个和等B．波森坦对ET的亲和力略高一个受体多于ETB受体。
波生坦在肝脏代谢后由胆汁排泄排出。在健康成人受试者中，最终消除半衰期约为5小时。波生坦在肝脏中由细胞色素P450酶CYP2C9和CYP3A4(可能还有CYP2C19)代谢，产生三种代谢产物，其中一种代谢产物Ro 48-5033具有药理活性，可能对母体化合物总活性贡献10 - 20%。
方法
需求
表1;表2
表1:紫外分光光度法分析波生坦的要求。
| 要求 | 制造商/来源 |
|---|---|
| 校准紫外可见分光光度计 | 岛津UV - 1800 |
| 校准电子天平 | 日本岛津公司 |
| 应用波生坦 | Cipla公司有限公司 |
| 应用波生坦平板电脑 | 125毫克 |
| 容量瓶(10、25、1000 ml) | 类BBorosil |
| 吸量管(2毫升) | 类BBorosil |
| 烧杯(50、100、250毫升) | Borosil |
| 简单的蒸馏水 | BhanuMini石英蒸馏器 |
表2:紫外线分析配方。
| 品牌名称 | Bosentas |
|---|---|
| 活性成分 | 应用波生坦 |
| 制造商 | Cipla公司有限公司 |
| 剂型 | 平板电脑——涂层 |
| 标签要求 | 125毫克 |
| 包 | 泡罩:每包10片 |
| 截止日期 | 07/2020 |
溶剂的选择
- 参考官方纲要(E.P, B.P)，发现波生坦是少量溶于水。
- 对药物在0.1M盐酸、0.1MNaOH等各种溶剂中的溶解度进行检测，发现药物在0.1M氢氧化钠中的自由溶解度，这是由于药物的碱性较弱。
- 选用0.1N氢氧化钠作为紫外分光光度分析的溶剂，光谱特征明显，呈高斯分布，吸光度好。
测定λ马克斯
通过反复试验，λ马克斯在0.1N氢氧化钠中紫外分光光度计检测到波生坦在261.00 nm处。
方法验证
线性范围:X轴为浓度，Y轴为吸光度，建立浓度范围为4 ~ 20μg/ ml的线性关系。相关系数(R2)，直线方程包括斜率(m)， y-截距(C)。
通过测定最高和最低浓度之间的差异，从线性研究中得出指定的范围。
精度
盘中精度(重复性):建立的方法的重复性由3个重复的3个浓度的9个测定来评估。计算结果为% RS。
Interday精度:开发的方法在3天内评估结果的差异(n= 6)。对获得的结果计算RSD %。
检测限和定量限:根据响应(空白样品)的标准偏差和校准曲线的斜率，采用仪器方法确定LOD和LOQ。
准确性:该方法的准确性通过对标准添加量从标签要求的50%、100%和150%三个水平的市场配方的回收率研究得到了证实。回收率研究分三份进行。
50%溶液的制备:取0.5ml样品原液(5μg/ ml)和0.25 ml以上标准原液II移到10ml容量瓶中，用稀释液稀释至刻度。
100%溶液的制备:取0.5ml样品原液(5μg/ ml)和0.5ml以上标准原液II，移入10ml容量瓶，用稀释剂稀释至刻度。
150%溶液的制备:取0.5 ml样品原液(5μg/ ml)和0.75ml以上标准原液II移到10ml容量瓶中，用稀释液稀释至标记。
紫外分光光度法验证了所建立方法的适用性
试验配方:准确称取20片，记录平均片剂重量为125 mg波生坦，粉末状。
将相当于0.0175mg波生坦的片剂粉末准确称量，转移到10ml容量瓶中，溶解在约5ml的溶剂(0.1 N氢氧化钠)中。
旋转30分钟，最大限度地提高剂型中有效药物成分的提取，并通过Whatmann No . 1滤纸过滤，最大限度地去除不溶性赋形剂。
然后用同样的溶剂使它达到同样的体积。这相当于10μg/ ml的波生坦。
从原液中制备与标准曲线中浓度(12μg/ ml)相对应的溶液，用溶剂补至标记处。
记录吸光度，然后从标准校准曲线确定相应的浓度。
结果与讨论
方法:紫外分光光度法测定波生坦
波生坦λmax的测定:图1
图1
图1:λ马克斯应用波生坦。
方法验证
线性:所得结果均在线性范围内，显示良好的相关系数值(0.9998)。图2和3;表3
图2
图2:波生坦覆盖光谱(4-20 μg/ ml)。
图3
图3:紫外分光光度法在261.00 nm处设置线性度的校准曲线。
表3:紫外分光光度法测定线性剖面。
| 浓度(µg / ml) | 在261.00 nm处的吸光度 |
|---|---|
| 4 | 0.237 |
| 8 | 0.498 |
| 12 | 0.736 |
| 16 | 0.976 |
| 20. | 1.226 |
精度
盘中的精度显示(可重复性):表4 - 6
表4:日内精密度日- I紫外分光光度法。
| 浓缩的(µg / ml) | 吸光度 | 平均 | SDa | % RSDb | ||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 组1 | 组2 | 集3 | ||||
| 4 | 0.236 | 0.238 | 0.235 | 0.236333 | 0.001528 | 0.646344 |
| 8 | 0.496 | 0.499 | 0.497 | 0.497333 | 0.001528 | 0.307143 |
| 12 | 0.735 | 0.737 | 0.736 | 0.736 | 0.001 | 0.13587 |
表5:日间精密度第II天用紫外分光光度法测定。
| 浓缩的(µg / ml) | 吸光度 | 平均 | SD | %相对标准偏差 | ||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 组1 | 组2 | 集3 | ||||
| 4 | 0.237 | 0.236 | 0.235 | 0.236 | 0.001 | 0.423729 |
| 8 | 0.497 | 0.498 | 0.496 | 0.497 | 0.001 | 0.201207 |
| 12 | 0.737 | 0.735 | 0.736 | 0.736 | 0.001 | 0.13587 |
表6:日间精密度第III天紫外分光光度法。
| 浓缩的(µg / ml) | 吸光度 | 平均 | SD | %相对标准偏差 | ||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 组1 | 组2 | 集3 | ||||
| 4 | 0.236 | 0.235 | 0.238 | 0.2363 | 0.001528 | 0.646344 |
| 8 | 0.497 | 0.498 | 0.499 | 0.498 | 0.001 | 0.200803 |
| 12 | 0.735 | 0.736 | 0.737 | 0.736 | 0.001 | 0.13587 |
| a=标准偏差，b=相对标准偏差百分比 | ||||||
Inter-day精度:建立的方法准确度高，3天内和3天内的结果的RSD < 2.0。表7
表7:紫外分光光度法测定日间精密度。
| 浓缩的(µg / ml) | 吸光度 | 平均 | SD | %相对标准偏差 | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 组1 | 组2 | 集3 | 组4 | 集合5 | 设置6 | ||||
| 4 | 0.238 | 0.235 | 0.236 | 0.237 | 0.235 | 0.236 | 0.23616 | 0.001169 | 0.495009 |
| 8 | 0.499 | 0.497 | 0.498 | 0.497 | 0.498 | 0.496 | 0.4975 | 0.001049 | 0.210816 |
| 12 | 0.737 | 0.736 | 0.735 | 0.737 | 0.736 | 0.735 | 0.736 | 0.000894 | 0.121525 |
检测极限:LOD = 3.3 δ/ m
= 3.3× 0.001528/ 0.0614
= 0.082124μg
定量的限制:LOQ = 10 δ/ m
= 10× 0.001528/ 0.0614
= 0.24886μg
检测限(LOD)和定量限(LOQ)结果令人满意。
准确性:＊3次实验的平均值
验收标准:每个级别的%回收率应该在98.0和102.0%之间
该方法测定结果准确，各水平的回收率均在限定范围内，RSD < 2.0。图4;表8
图4
图4:紫外分光光度法测定波生坦的覆盖谱。
表8:用紫外分光光度法从处方(波生坦片)中回收。
| 波生坦的剂型 (µg ml-1) |
Pure Bosentan补充道 | 纯应用波生坦 添加(µg ml-1) |
应用波生坦恢复% ±% rSD = * |
|---|---|---|---|
| 5 | 50％ | 2．5 | 101.02±1.17 |
| 5 | 100％ | 5 | 101.90±1.12 |
| 5 | 150％ | 7．5 | 102.00±0.17 |
| *平均3次实验 | |||
紫外分光光度法验证了所建立方法的适用性
试验配方:验收标准:95- 105% w/v
检测结果符合合格标准。表9
表9:紫外分光光度法测定处方(波生坦125mg片)的含量。
| 配方 | 吸光度 | 标签要求 | 发现数量 | %测定量±SD* |
|---|---|---|---|---|
| 应用波生坦 | 0.741 | 125毫克 | 11.934 | 99.45% |
| 0.735 | ||||
| 0.731 |
讨论
对所提方法进行了验证。通过三个不同水平的回收率研究来评估方法的准确性。回收实验表明，无常见药物添加剂的干扰。结果表明，该方法精密度高，RSD < 2。所有统计数据证明了方法的有效性，可用于药品剂型的常规分析。
结论
从上述实验结果和参数得出结论，该新发展的波生坦估计方法简单、精确、准确;该方法具有较高的可接受性和成本效益，可在不久的将来有效地应用于科研机构、行业质量控制部门、认可检测实验室的常规分析。
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