目的:射血分数降低的心肌病(CMP)在有长期每日大量饮酒史的受试者中呈剂量依赖性发展。乙醇改变包括兴奋-收缩肌肌耦合在内的心脏转导信号，导致舒张期和收缩期左室功能障碍。肌提素是一种巨型结构肌丝宏蛋白，参与心脏收缩功能，参与心肌细胞弹性反冲，是舒张期左室充盈的关键因素。

我们评估了酒精性CMP中titin的表达是否受慢性高剂量乙醇摄入的影响。

方法和结果:我们总共分析了30个来自人类器官捐赠者的心脏样本:20个来自高酒精消费者(10个没有CMP, 10个有CMP)和10个健康对照组。患者的评估包括每日和终生乙醇消耗量、胸部X线、二维超声心动图和左室组织学。根据功能和组织学标准评估CMP。通过特异性免疫组化(IHC)和转录本表达(rtPCR)测定肌素活性。

肌素IHC表达明显存在于肌细胞的肌节区。与健康供者(82.58±3.36)相比，饮酒者心肌titin表达显著降低(71.29±3.16;减少13.67±3.83%;p=0.04)， CMP饮酒者(62.31±4.18;与无CMP组相比(80.27±2.62;与对照组相比下降2.80±3.17%;p<0.0030 vs.酒精CMP)。肌提素转录水平证实了类似的表达模式。

结论:慢性酒精摄入可减少心肌肌动蛋白的表达，特别是在CMP已经形成的情况下。肌提素参与了酒精性CMP的多因子致病过程。

酒精，前颗粒蛋白，心肌，肌提蛋白表达，心肌病。

目的:射血分数降低的心肌病(CMP)在有长期每日大量饮酒史的受试者中呈剂量依赖性发展。乙醇改变包括兴奋-收缩肌肌耦合在内的心脏转导信号，导致舒张期和收缩期左室功能障碍。肌提素是一种巨型结构肌丝宏蛋白，参与心脏收缩功能，参与心肌细胞弹性反冲，是舒张期左室充盈的关键因素。

我们评估了酒精性CMP中titin的表达是否受慢性高剂量乙醇摄入的影响。

方法和结果:我们总共分析了30个来自人类器官捐赠者的心脏样本:20个来自高酒精消费者(10个没有CMP, 10个有CMP)和10个健康对照组。患者的评估包括每日和终生乙醇消耗量、胸部X线、二维超声心动图和左室组织学。根据功能和组织学标准评估CMP。通过特异性免疫组化(IHC)和转录本表达(rtPCR)测定肌素活性。

肌素IHC表达明显存在于肌细胞的肌节区。与健康供者(82.58±3.36)相比，饮酒者心肌titin表达显著降低(71.29±3.16;减少13.67±3.83%;p=0.04)， CMP饮酒者(62.31±4.18;与无CMP组相比(80.27±2.62;与对照组相比下降2.80±3.17%;p<0.0030 vs.酒精CMP)。肌提素转录水平证实了类似的表达模式。

结论:慢性酒精摄入可减少心肌肌动蛋白的表达，特别是在CMP已经形成的情况下。肌提素参与了酒精性CMP的多因子致病过程。

酒精，前颗粒蛋白，心肌，肌提蛋白表达，心肌病。

酒精性心肌病(CMP)的特征是在高剂量持续饮酒的受试者中出现左心室扩张(LV)表型[1-3]，这与遗传相关的心肌病相似。在发达国家，23 - 47%的扩张cmp与酒精滥用[4]有关，这种疾病的发展是累积的、剂量依赖性的[5,6]。在三分之一到四分之一的长期过量酒精消费者中发现，他们的平均终生累积酒精剂量>10 Kg乙醇/Kg体重)[1,7]，它是包括心律失常和心衰发作在内的高发病率的原因[8-10]。

过量的乙醇摄入会对心肌产生渐进的、多因子的损伤，并诱发多种有害效应[3,7,11]，其中大部分是同步的、协同的[7]，目前仅部分了解[11,12]。在酒精性CMP的自然史中，这些病理机制首先产生舒张期心肌[13,14]，然后是收缩期心肌功能障碍[5]，并伴有进行性心室扩张和结构改变(肌细胞肥大、坏死和间质纤维化)的发展，导致肌细胞凋亡和细胞丢失，诱发所谓的酒精性CMP[1,4,7]。

酒精诱导的心脏损伤最相关的机制之一与心肌结构蛋白的破坏有关[15,16]。酒精减少心脏蛋白质的合成，改变其表达和功能，并增加其降解。肌原纤维蛋白是这一过程中最常受影响的蛋白质之一。因此，在啮齿类动物模型[16]中，肌动蛋白和α-肌球蛋白减少40%，其mRNA转导过程减少，导致肌节收缩进行性减少，心室功能障碍和进行性心功能损伤。酒精诱导的心脏损伤还涉及其他结构蛋白(肌钙蛋白、锚蛋白、桥摩蛋白)、非结构蛋白(线粒体、核糖体、热休克蛋白)和调节心脏蛋白(肌生长抑制素、IGF-1、FGF21和其他心脏肌因子)[7,16-22]。酒精诱导心脏损伤的这一顺序过程与评估每个特定蛋白[12]的作用有关。

肌提素是一种巨大的结构性肌丝巨蛋白，已被证实与心脏收缩功能密切相关[23-25]。该大蛋白在功能上与被动心肌僵硬度和应激敏感信号[26]相关，并在很大程度上参与心肌细胞的弹性后坐力，这是Frank-Starling舒张舒张过程中参与左室充盈的关键决定因素[24,25,27]。肌提素力与细胞外基质共同定义被动心肌硬度[26-28]。因此，肌提素在心脏病中起着重要作用，并参与结构性CMP，如遗传性扩张型和肥厚型CMP[29]和心律失常性右心室发育不良[30]。肌素在人类缺血性心脏病[31]中的潜在参与，以及肌素在舒张性心力衰竭中的作用al[32,33]也有报道。事实上，“心脏肌素疾病”一词已被用于包括与肌素相关心脏损伤[26]中涉及的正常肌素蛋白的突变、亚型变异、翻译后修饰、过磷酸化和上调相关的各种心脏病。在慢性酒精喂养大鼠横纹肌的实验研究中已经报道了基因表达和肌提素含量(连接素)的变化[34,35]。

被动心肌僵硬和应激敏感信号的过程已经在酒精性CMP的自然历史的第一步中被描述过[27,32]，超声心动图显示三分之一的慢性无症状男性在终生服用酒精>5 kg乙醇/kg体重[14]的情况下出现舒张功能障碍。最近有证据表明，肌肽截断变异是酒精性CMP的一种普遍的遗传易感体质，也与酒精摄入量超过推荐水平[36]的扩张型CMP患者左心室射血分数较差有关。然而，迄今为止，提丁参与酒精性CMP的研究很少。因此，我们推测，在慢性酒精性CMP的进行性致病过程中，乙醇可能影响心脏肌素含量和功能。

本研究的目的是评估心肌结构肌肉瘤蛋白肌肽在酒精诱导的心脏损伤中的潜在参与。我们使用来自心脏供体的人心肌组织，通过免疫组化(IHC)或转录水平方法，比较长期酗酒者(含或不含CMP)与无心脏病的非酗酒者(健康对照供体)的肌氨酸心肌表达程度。

在2006年1月至2011年12月的一项为期五年的前瞻性研究中，我们连续研究了巴塞罗那(西班牙巴塞罗那)Clínic医院移植团队认为适合作为器官捐赠者的创伤性或脑血管性脑死亡受试者的心脏。心肌结构和功能数据和组织样本分别来自移植手术前后年龄匹配(+ 2岁)的人体器官捐献者。

在120名70岁以下的尸体供体中，62颗心脏不适合移植，4个样本没有被恰当地招募。在这58个后一种器官中，我们最终选择:(i) 20个有10年以上乙醇摄入量≥60 g/天的供体(10个无CMP和10个有CMP)， (ii) 10个对照心脏来自因缺乏匹配受体或大小不足而不适合植入的健康人。

所有病例均住进重症监护病房，住院期间呼吸和血流动力学参数均适当维持在正常值:收缩压>100 mmHg, P_一个O₂>60 mmHg，动脉pH值在正常范围内。所有患者均不需要住院进行心肺复苏。

所有的捐赠者都是西班牙裔白人，他们和家人住在巴塞罗那或附近，没有一个是贫困的。研究方案由巴塞罗那医院Clínic的伦理和研究委员会批准(参考编号HCB/2012/8005)，所有捐赠者家庭都对在本研究中使用心肌组织提供了知情同意。患者的所有程序都遵循《期刊编辑行为准则和最佳实践指南》和《期刊出版人行为准则》(COPE)中提供的指导，以及《赫尔辛基宣言》中概述的原则。其中三分之一的研究对象曾参与过心肌生长抑制素活性[19]和心肌IGF-1活性[20]的研究。

使用结构化问卷(“时间线跟踪法”)[37]，通过咨询家庭成员，回顾性获得乙醇摄入的详细历史，如之前类似研究报道的[5,19,38]。每组的乙醇摄入持续时间按近年来累计的最近或以前的酒精摄入时间计算。体重指数(BMI)被确定为当前体重相对于身高的平方(BMI, Kg/m)²)．如果BMI < 17 Kg/m，则认为患者存在热量营养不良²．通过入院时获得的以下参数评估蛋白质营养不良:血红蛋白、淋巴细胞计数、总蛋白、视黄醇结合蛋白、前白蛋白和白蛋白。

通过临床图表复习确定心衰症状及吸烟史、糖尿病、脑血管病、高血压、缺血性心脏病史等危险因素，按美国心脏协会标准[39]确定功能分级。进行胸部x光检查，测量胸腔指数，常规心电图(ECG)和二维超声心动图(Hewlet Packard Sonos 2500, USA)。按照美国超声心动图学会[40]标准测量舒张末期和收缩期内径指数、缩短分数、左室质量和射血分数(EF)。CMP被定义为左室射血分数(LVEF) <50%和明显的左室增大，以及组织学证实的心脏结构性损伤。执行和评估这些测试的人员对患者的酗酒史一无所知。

染色:为了进行心肌组织学研究，手术切除左室心尖远端3cm样本(总重量4-5 g)，供体处于冷灌注状态。标本被切割成碎片，其中一个碎片被处理用于进一步的转录研究，并保持在-80℃冷冻。其余碎片用液氮快速冷冻，直到免疫组化研究。在组织学研究中，标本在半薄切片上用苏木球蛋白(H&E)和甲苯胺蓝染色。两名独立观察员(JF-S和P-M)对分组不进行盲法，评估了心肌细胞和核肥大、肌细胞溶解(定义为肌纤维紊乱或细胞空化)和间质纤维化的程度，如之前报道的[38]。在意见不一致的情况下，建立协商一致的协议。根据既往组织学定义的标准，整体组织学受累程度分为正常、轻度、中度或重度(0/+/++/+++)[38,41]。

采用常规免疫组化方法评价心肌组织素表达。在这些实验中，在显微镜下观察到肌素多克隆表达，在存在蛋白的心肌细胞的肌肉瘤区作为一种浅棕色色素。表达强度与肌节肌肽含量[42]直接相关。取供体心脏标本，用超显微显微镜取6μm半薄切片，用4%的多聚甲醛PBS溶液在pH值7.40下固定30min。PBS洗涤后，切片用0.1% Triton X-100柠檬酸钠溶液在4ºC下渗透2分钟，与血清一起洗涤20分钟。在4ºC下与抗肌肽马多克隆血清(Abcam 7034, Cambridge, UK)孵育18小时。

第二天，PBS/Triton 0.1%溶液涂抹5分钟，然后与二次生物素抗体室温孵育30分钟，重复冲洗溶液。随后，切片与ABC (Avidin-Biotin Complex, Vectron k -7200, Burlingame, CA, USA)在室温下孵育30分钟，再次在PBS/Triton 0.1%溶液中洗涤。用二氨基联苯胺显色剂减显10 min，显微镜控制下，PBS/Triton 0.1% 5 min，蒸馏水冲洗，H&E染色。样品脱水后用DPX贴装液覆盖进行组织学研究。

阴性对照载片均采用相同工艺，无试剂孵育。根据先前描述的方法[19]，由两名不同的合格观察员(JF-S和P-M)在每个样本的至少6个不同的野区(放大250倍)进行肌素定量，每个野区至少有500个肌细胞。肌素IHC指数的计算方法是:将肌素试验中高度阳性的心肌细胞总数除以评估的心肌细胞总数，并将该值乘以100，如其他地方所述[19,38]。非肌细胞或位于组织边缘或间质中的肌细胞未被计数。

RNA分离和实时PCR。使用Tripure (Roche, Indianapolis, IN)提取总RNA。逆转录酶在20 μl中进行，使用随机六聚体引物(Applied Biosystems, Foster City, CA)和0.5 μg RNA。PCR重复进行以提高准确性。每个25 μl的反应混合物包含1 μl cDNA、12.5 μl TaqMan通用PCR主Mix (Applied Biosystems)、250 nM探针和900 nM引物，引物来自于assays -按需基因表达检测Mix或Assaysby-设计基因表达检测Mix (Applied Biosystems)。使用Taqman基因表达测定法。每个样本重复运行，取其平均值计算感兴趣基因和管家参考基因(18S)的mRNA表达量。每个样本中感兴趣的基因的数量按照制造商的说明使用比较(2-DeltaCT)方法归一化到参考对照的基因的数量。

数据采用SPSS v22统计软件进行分析。在采用Kolmogorov-Smirnov检验和Shappiro wilkokon检验参数正态分布后，采用单因素方差分析(单因素方差分析)寻找组间差异。计算变量之间的Pearson相关系数。所有变量服从正态分布，用均数±均数标准误差(SEM)表示。双尾P值<0.05被认为具有统计学意义，可信区间(CI)为95%。

在供体评估后，我们共收集了30个心脏样本。其中20例为慢性酒精消费者(10年饮酒量为bb0，每日饮酒量为60克)。在心脏研究之后，来自慢性酒精消费者的样本被分为两组:一组没有扩张CMP的证据(显示LVEF >50%，没有心肌结构损伤的组织学征象;n=10)， 1例CMP扩张(LVEF <50%，有心肌结构损伤的组织学征象;n = 10)。此外，在同一时期，10名没有心脏病证据的健康非酒精供体与酒精组的年龄(+ 2岁)和性别匹配，也纳入了研究。

表1总结了本研究纳入的有和没有扩张型CMP和对照组的酒精消费供体的平均临床和流行病学数据。三组患者的年龄和性别相似。在所有的对照组供者中都没有蛋白质或热量营养不良，而在2名患有CMP的酒精消费者和2名没有CMP的酒精消费者中存在蛋白质或热量营养不良，三组之间的bmi是相似的。20例慢性酒精消费者中的12例(60%)有稳定的肝病，与非酒精消费者对照组相比，天冬氨酸转氨酶(平均62+12 IU/L)和谷氨酰转肽酶(平均73+15 IU/L)水平有中度升高(p<0.05)。正如预期的那样，与没有CMP的人和对照组相比，患有CMP的酒精消费者的每日酒精摄入量、酒精摄入持续时间和终生酒精消费显著更高，这与以前的临床系列报告[38]一致。与对照组相比，饮酒者的脑血管死亡更为频繁。40%无CMP的酒精消费人群和所有有CMP的酒精消费人群均表现出功能异常。与无CMP的酒精消费者和对照组相比，CMP酒精消费者的胸心指数、收缩期末和舒张期末左室直径显著升高，LVEF显著降低。我们观察到胸心指数与左心室舒张末期内径有良好的相关性(r=0.68, p<0.01)。在无CMP的酒精消费人群中有40%出现心电图异常(左室肥厚、早搏、传导和复极缺陷)，在有CMP的酒精消费人群中有70%出现心电图异常。

表2是根据心肌组织学研究中应用的半定量评分(不存在/低/中/重度)给出的组织学损伤程度。正如预期的那样，与无CMP的对照组和非酒精消费对照组相比，有CMP的酒精消费组表现出更大程度的组织损伤(肌细胞肥大、坏死和间质纤维化)(p<0.05)。

IHQ阴性对照仅用苏木精染色(图1A)。在对所有肌素IHC表达的样本进行处理和显微镜评估后，使用肌素特异性抗体的肌节区域呈深棕色，显示明显阳性(图1B)。肌素表达在肌细胞间的变异性值得注意(图1B)，因为一些心肌细胞明确表达肌素，而另一些心肌细胞表达低，其中一抗没有被肌节捕获。

表2和图1和图2显示了心肌titin IHC的表达情况。首先，我们比较了健康供体与两组酒精消费供体的肌动素IHC表达比例，发现酒精消费供体心肌肌动素表达明显较低(健康供体82.58%+3.36，慢性酒精消费供体71.29+3.16,p=0.04)。

为了评估CMP的存在是否与心肌肌titin IHC活性相关，我们根据CMP的存在或不存在将酒精消费供者分组，并与对照组供者进行比较。表2显示了这三组的均值和95% CI。我们观察到，与无CMP的慢性酒精消费者相比，有CMP的慢性酒精消费者IHC肌素活性显著降低(62.31+4.18% vs. 80.27+2.62%，

p = 0.003)。同样，与健康对照组非酒精消费人群相比，酒精消费人群CMP中的titin IHC表达显著降低(62.31+4.18% vs. 82.58+3.36%， p=0.0009)。

图1C和1D显示了根据有无CMP而不同的titin IHC表达。因此，与具有CMP的慢性酒精消费供体(图1D)相比，无CMP的慢性酒精消费供体(图1C)在肌细胞中呈高比例的肌肥大蛋白表达阳性(与健康对照组非酒精消费供体相似)，后者在IHC中有明显的肌肥大蛋白表达下降。

图3显示了评估的不同供体组与心肌肌肽表达百分比(高肌肽ihc阳性细胞的%)之间的关系。

为了证实这些发现，在所有研究组中，通过转录试验平行评估了Titin水平，发现了与通过IHQ评估相似的模式(图3)。

本研究的目的是评估慢性酒精摄入和CMP的存在对不同人群心脏供体中肌提素表达的影响。为了达到这一目的，我们对来自健康对照人供体和高剂量慢性酒精摄入供体的心肌组织进行了免疫组化染色和转录分析，以检测心肌细胞中肌节肌素蛋白的表达。

如前所述，在健康的非酒精消费对照供体的大多数心肌细胞(83%)的肌瘤区，肌提素以特征性的棕色染色明确表达[42,43]。通过比较健康的非酒精消费对照组和所有慢性酒精消费对照组，我们发现在摄入大量酒精的供体中，肌沉蛋白的心脏表达明显较低，证明了慢性酒精消费对降低肌沉蛋白IHC心脏表达的直接影响。此外，当我们评估扩张型CMP在酒精消费供体中的作用时，我们还观察到，与无CMP的心肌酒精消费供体和非酒精消费供体相比，心肌CMP的心肌酒精消费供体的IHC肌素显著降低。这些不同的Titin表达模式，尽管不显著，但被替代的转录检测技术证实，我们发现与非酒精对照相比，在受CMP影响或不受CMP影响的慢性酒精消耗者中，Titin 18/SR mRNA转录水平有降低的趋势。这提示心肌细胞Titin mRNA转录含量的降低可能主要与慢性酒精效应有关，而不是与CMP的存在有关，蛋白表达比转录更相关。

此外，在CMP存在的情况下，酒精对心肌细胞肌肽IHC表达的负面影响与其他肌动蛋白和肌球蛋白等肌肉瘤结构蛋白的情况一致，这些蛋白也受到酒精滥用的影响[16,44]，可能是由于心脏重构过程[45,46]。以肌动蛋白为例，由于它是一种与心脏舒张过程功能相关的肌肉蛋白[26,47]，本研究的发现提供了额外的证据，证明慢性乙醇摄入可导致三分之一的慢性酒精滥用者左室舒张功能障碍[13,14]。

然而，肌素肌细胞表达的降低并不是酒精诱导的CMP所特有的，因为肌素含量也可能因许多其他心脏损伤原因而降低，如遗传性肥厚和扩张型CMP[29]、缺血性心脏病[31]、特发性扩张型CMP[28]、动脉高血压[42,48]和心律失常性右心室发育不良[30]。事实上，术语“心肌肌动蛋白疾病”已经被提出，包括所有与肌动蛋白功能障碍有关的心脏疾病[26]。

与临床水平类似，不同的大鼠实验研究评估了慢性酒精摄入是否会破坏心肌收缩蛋白[12,15,44]。具体来说，酒精使α-肌动蛋白亚型和肌凝蛋白重链减少40%，但增加β-肌动蛋白亚型[16]。在长期乙醇喂养的大鼠心肌中，基因表达和异构体组成的变化，而不是肌氨酸总含量的变化，表明这些变化与病理过程[35]的发展有关。根据这些肌原纤维蛋白的变化，一些涉及线粒体功能、膜相关蛋白、糖酵解酶、转导信号肌浆蛋白、遗传转导相关蛋白和抗氧化机制的非结构心肌蛋白受到慢性酒精摄入的影响[12,16]。此外，热休克蛋白也明显减少，导致心肌保护机制[18]的损失。关于肌肽，在大鼠实验研究中，当心室肥厚[42]增加或肺动脉高压[49]存在时，肌肽心脏亚型表达降低。肌素的减少可能导致肌肌功能不足，并有助于扩张的CMP[28]的发展。因此，当肌提蛋白等结构蛋白发生改变时，乙醇本身对心肌细胞[7]的多重作用进一步增强。

关于研究的局限性，由于本研究是在人类心脏供体中进行的，由于获得这种类型的人体标本的难度，样本量受到限制，这可能会在转录分析的情况下减少一些具有困难统计结果的组比较。本研究未分析肌素翻译后修饰、磷酸化或肌素基因型的其他变化。肌素表位可能影响本研究中使用的抗肌素抗体[36]的结合特异性。因此，肌肥大蛋白表达的变化仅与酒精性CMP相关，并没有证明肌肥大蛋白与酒精性CMP之间存在因果关系。同样，舒张功能的评估也不包括在供体心脏的评估中。最后，通过咨询心脏捐献者的家庭和亲属，回顾性评估了酒精摄入量。

尽管有这些不便，根据本研究的结果，我们可以得出结论，慢性过量饮酒显著降低了肌氨酸蛋白心肌表达，当心脏结构损伤和重构存在时，这种酒精诱导的效应更高。由于titin是一种与左室扩张性相关的结构蛋白，这种titin表达的降低可能证明了之前所述的三分之一慢性酒精使用者在CMP亚临床期中出现的左室舒张功能障碍[13,14]。这一事实也可能与射血分数保留的所谓心力衰竭的发展有关[33,48,49]。

肌提蛋白心脏表达可作为亚临床酒精扩张性CMP第一步出现的酒精诱导心脏损伤的额外标记物。在心脏重构和扩张CMP的过程中，心肌中titin的表达明显降低。保存心肌组织素活性和其他心脏蛋白、避免蛋白质营养不良、缺乏体育锻炼和氧化损伤、稳定肝脏或其他酒精相关全身疾病[50]的策略可能有助于预防酒精性CMP中心功能障碍和结构损伤的进行性发展。

这项工作得到了加泰罗尼亚总院2014-1158支持Grups de Recerca赠款的支持;Fisiopatología de la Obesidad y la Nutrición，马德里卡洛斯三世学院。西班牙和La Marato TV3 2015/33 30/31加泰罗尼亚总督。