由于定量反转录PCR (qRT-PCR)的灵敏度和特异性，它仍然是检测SARS-CoV-2病毒的金标准。然而，qRT-PCR分析的成功设计需要准确的病毒基因组序列。随着病毒在全球传播，突变不断积累，我们试图将世界卫生组织推荐的当前检测方法与现有的SARS-CoV-2基因组序列进行比较在网上。虽然大多数序列被保守，但是存在显着的不匹配，特别是在与最近的分离物相比使用早期序列开发的测定中。我们建议评估用于诊断测试的任何测定与来自所提出的测试区域的普遍存在的序列数据进行比较，并且继续通过研究界继续提供公开可访问的序列信息。

中存在;SARS-CoV-2;基因组序列;引物

由于定量反转录PCR (qRT-PCR)的灵敏度和特异性，它仍然是检测SARS-CoV-2病毒的金标准。然而，qRT-PCR分析的成功设计需要准确的病毒基因组序列。随着病毒在全球传播，突变不断积累，我们试图将世界卫生组织推荐的当前检测方法与现有的SARS-CoV-2基因组序列进行比较在网上。虽然大多数序列被保守，但是存在显着的不匹配，特别是在与最近的分离物相比使用早期序列开发的测定中。我们建议评估用于诊断测试的任何测定与来自所提出的测试区域的普遍存在的序列数据进行比较，并且继续通过研究界继续提供公开可访问的序列信息。

中存在;SARS-CoV-2;基因组序列;引物

在新冠肺炎大流行等危机中的感染暴发期间，诊断是控制感染率的关键步骤，特别是在临床症状难以与流感等其他呼吸道感染区分的情况下。公共卫生措施决定，如需要进一步隔离和监测的患者和接触者追踪，与疑似病例是否得到确认密切相关。因此，这种测试的速度和准确性至关重要，因此开发和应用敏感和可靠的诊断测试是至关重要的。

在现有的几个平台中，定量(实时)逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)仍然是诊断新型冠状病毒SARS-CoV-2的主要手段，利用与病毒遗传物质的特定序列互补的短DNA寡核苷酸(引物和探针)，因此，qRT-PCR诊断检测是基于病毒遗传物质的检测，需要准确的设计，以确保检测的敏感性和特异性[2,3]。每条DNA链上都有一个引物作为DNA聚合酶的起始点，该酶进行RT-PCR反应，而探针在引物位点之间结合，并赋予特异性。引物和探针的设计基于自2019年12月底以来公开获得的病毒基因组序列，通常以开放阅读框(ORF) 1ab、包膜(E)和核衣壳(N)编码区[4]为目标区域。

在Covid-19诊断中的主要挑战之一是使用QRT-PCR的SARS-COV-2遗传物质的检测灵敏度和特异性是可变的，有时是低[5]。多种因素可能导致SARS-COV-2检测的低灵敏度：临床采样的位置;低患者病毒载荷;零星脱落;来自不同制造商的检测套件的变化。确定试剂盒检测灵敏度的关键因素之一是有效的引物和探针结合靶遗传物质。这反过来依赖于套件制造商使用最适合的病毒基因组序列数据。我们假设SARS-COV-2分离株之间的突变可能导致引物和探针的不完美结合，并且可能有助于QRT-PCR检测和敏感性的持续问题。为了测试我们的假设，我们在世界卫生组织（世卫组织）推荐的Genbank和探针 - 底漆测试集中获得了375 SARS-COV-2基因组的序列对齐。

在三个主要的电子数据库（PubMed，Embase和Cochrane图书馆）中进行了系统搜索，以识别出版的研究检查严重急性呼吸综合征（SARS），中东呼吸综合征（MERS）和2019年的诊断，治疗药物和疫苗新的Coronavirus（2019- NCOV），按照系统评价和荟萃分析的首选报告项目（PRISMA）指导方针。

截至2020年4月6日，GenBank共获得447个SARS-CoV-2（COVID-19病原体）序列，包括375个大于29161bp的完整或接近完整基因组（以下简称全基因组），72个87bp至1411bp的部分基因组序列。

所有375个全长序列都被下载，并使用生物信息软件geneous version 11.1 (Biomatters, Auckland, New Zealand)创建了一个自定义的SARS-CoV-2基因组数据库。PCR方法来源于WHO、US CDC等出版物。在自定义的SARS-CoV-2基因组数据库中，使用blastin(具有低复杂度过滤器，最大e值10，间隙成本52)对每个协议的引物和探针进行blast搜索，并使用geneous version 11.1进行多序列比对分析。

我们对WHO网站[6]上公布的方案中列出的SARS-CoV-2 qRTPCR引物和探针进行了硅质评估。总结结果如表1所示，详细说明如下:

中国疾控中心的方案旨在扩增SARS-CoV-2 ORF1ab和N区。对于ORF1ab区域，正向引物和探针对375个全基因组序列中的374个结合位点具有100%的同源性。反向引物与全基因组序列有1 bp的错配。然而，在国外报道的13个SARS-CoV-2序列中，N个基因的前导引物5′端前3 bp与目的位点存在3个碱基对错配。他们分别来自西班牙、以色列、印度和秘鲁,和9基因组序列来自美国(图1)。这是重要的,作为一个PCR反应与引物与引物3 bp不匹配等候网站可能不是功能,即PCR可能产生假阴性结果应用于上述SARSCoV - 2感染样本。另外，正引物与序列MT263410 (SARS-CoV-2/ human/USA/WA-UW330/2020)和MT246456 (SARSCoV- 2/human/USA/WA-UW199/2020)不匹配1个位点，与序列MT263411 (SARSCoV- 2/human/USA/WA-UW331/2020)不匹配2个位点。

接下来，我们研究了来自巴黎Institut Pasteur的SARS-COV-2的QRT-PCR测定。引物和探针序列基于在GISAID数据库上提供的第一个SARS-COV-2序列，在2020年1月11日上可用。设计引物和探针（NCOV_IP2和NCOV_IP4）以靶向RNA依赖性RNA聚合酶（RDRP）在跨越NT12621-12727和14010-14116的ORF1ab区域内的基因（根据SARS-COV，NC_004718的位置）。来自Charité议定方案的E基因测定用作确认测定。

Institut Pasteur RDRP基因QRT-PCR引物和靶位点（RDRP基因/ NCOV_IP2和RDRP GENE / NCOV_IP4）的探针对374/375全基因组序列的结合位点具有100％的同一性。两种PCR的反向引物分别具有1bp的序列MT226610（SARS-COV-2 /人/ KMS1 / KMS1 / 2020）和MT259238（SARS-COV-2 /人/ USA / WA-UW246 / 2020）。。确认E基因QPCR的引物和探针具有100％同一性，在Genbank中可用376/377 SARS-COV-2 E基因序列。探针与序列MT039890（武汉进口的韩国患者分离出SNU01）的1bp失配。

目前美国疾病预防控制中心提供的SARS-CoV-2检测方案包括N基因内的两个靶点。uscdcngene1靶向引物和探针与GenBank中SARS-CoV-2有效N基因（靶1）序列的同源性为100%（387/387）。N基因2靶引物和探针与SARS-CoV-2序列的98.4%（379/385）N基因（靶2）具有100%的同源性。探针有1个bp与两个序列不匹配，即MT263435（SARS-CoV-2/human/USA/WA-UW355/2020）和MT263458（SARSCoV-2/human/USA/WA-UW379/2020）。正向引物与1个序列（MT258382，SARS-CoV-2/human/USA/CZB-RR057-014/2020）存在1bp的错配。

日本的方案包括凝胶PCR和qRT-PCR方案。这里只有qRT-PCR引物和探针在硅中进行评估。引物和探针与99.5% (384/386)SARS-CoV-2序列的结合位点符合率为100%。探针与序列MT159720 (2019-nCoV/USACruiseA- 4/2020)错配1 bp，正引物与序列LC534419 (SARS-CoV-2/Hu/Kng/19-437 RNA，来自日本)错配1 bp。

该诊断检测方案于2020年1月17日在柏林公布，包括RdRp和E基因qRT-PCR，使用一种针对SARS-CoV-2 RdRp的探针(P2)和一种与SARS-CoV和蝙蝠sars相关cov以及SARS-CoV-2交叉反应的普通探针(P1)。另一组引物和探针是针对SARSCoV- 2的E基因的。在加拿大，安大略省公共卫生部门使用E基因扩增法进行检测，RdRp基因扩增法进行[7]确认。RdRp基因引物和探针与GenBank中100%(388/388)的SERS-CoV-2 RdRp基因序列的连接位点完全一致。E基因qPCR引物与探针的同源性为99.7%(375/376)。E基因探针仅与1个E基因序列MT039890(来自韩国的ser - cov -2/ sn01)失配1 bp。

香港的qPCR方案包括以f1b-nsp14为靶标的第一检测方法和以N基因为靶标的第二检测方法。orf1b引物和探针与99.5%(373/375)的SARS-CoV-2序列匹配良好。反向引物与序列MT163712(来自伊朗的SARS-CoV-2/ human/IRN/mehr1/2020)和MT276327 (SARSCoV- 2 isolate SARS-CoV-2/h human/ USA/GA_2742/2020)有1个碱基差异。N基因引物和探针与99.5% (383/385)SARS-CoV-2序列的靶序列完全匹配。该探针与序列MT263458 (SARS-CoV-2/ human/USA/WA-UW379/2020)和MT263435 (SARSCoV- 2/human/USA/WA-UW355/2020)有1个碱基不同。

泰国公共卫生部医学部使用了一种针对N基因的分析方法。引物和探针序列与GenBank提供的386个SARS-CoV-2序列中的一个序列完全相同。序列MT184913（2019 nCoV/USA-CruiseA-26/2020）有一个模棱两可的代码“Y”（用于C/T），它有50%的可能性与反向引物的“C”对齐。

在查看可用的引物和探针序列后，它看起来好像目前（4月2020）SARS-COV-2的QRT-PCR检测的大多数序列都很大程度上与当前报告的基因组序列相匹配。中国CDC N基因引物和来自包括西班牙，以色列，印度，秘鲁和美国在内的五个不同国家中分离的三种BP差异强调了继续监测PCR协议性能的重要性，并在更多的时候重新评估它们序列可用。

鉴于获得挑战临床样本病毒可能是检测和实验室之间的差异,甚至单个bp在引物序列不匹配表示错误的5%,根据其位置和替换的性质,这些可能会影响性能的反应和产生假阴性的结果[8]。事实上，在2009年H1N1大流行期间分发的qRT-PCR检测试剂盒中，单个碱基对的不匹配被证明降低了敏感性。该评价仅对引物和探针序列进行。其他特性，如退火温度，引物二聚体和发针形成的可能性引物和探针没有评估。鉴于这些因素对qRT-PCR效率的重大贡献，序列变化代表了在考虑诊断测试时的一个重要点。

SARS- cov -2可能以与第一代SARS冠状病毒相似的速度变异，每年每个基因组超过60个突变[10]。因此，重要的是，继续分享测序数据变得越来越重要，因为大流行目前没有显示出减缓的迹象，并可能继续传播数年。截至2020年4月中旬，GISAID hCoV-19数据库中已经有超过8000条序列显示了相当大的系统发育多样性[11-13]。同样需要注意的是，测序错误也可能在错误的序列中起作用，但这在上述13个分离株中不太可能出现保守突变。

在当前的紧急情况下，qRTPCR的低敏感性意味着许多COVID-19患者可能无法被识别，可能无法及时得到适当的治疗;鉴于病毒的高传染性，这类患者构成了感染更多人群的风险。特别是在世界各国都急于获得足够的检测能力和制定遏制策略[14]的情况下，确保引物和探针的设计与不断变化的SARS-CoV-2基因序列保持同步尤为重要。

这项工作是由安大略省农业和农村事务部(OMAFRA)和“思想中的食物”研究项目赠款给JL的。

此稿件已被释放为Medrxiv（Doi：https://doi.org/10.1101/2020.04.22.200756 97）。