BMP蛋白质是高度保守的蛋白质，没有成熟的功能GydF4y2Bab . burgdorferiGydF4y2BaSensu Lato和免疫原性。据报道，来自该集群的四个基因GydF4y2BaBMPD-BMPC-BMPA-BMPBGydF4y2Ba表达在GydF4y2Ba体外GydF4y2Ba作为单障碍和多排名消息。GydF4y2Ba

本报告中提出了证据，即BMPA mRNA含有分隔的90个碱基对的两个核糖体结合位点（SD）。SD1在小型32氨基酸ORF - 前导肽（BMPAL）之前。SD2是342氨基酸BMPa的RBS。BMPAL和BMPA ORFSGydF4y2BaB.burgdorferiGydF4y2Ba297重叠八个碱基对表明两种蛋白质可以共同调节。在SD2中的前列肽和“-GGG-”中的前五个密码子很少在博尔塞里亚使用，表明它们可以调节BMPAL和BMPA表达。在引导序列中删除SD1，或在SD2之前立即引入止挡密码子，以增加包含的B.Burgdorferi 297中的BMPA :: GFP表达式GydF4y2BabmpA:绿色荧光蛋白GydF4y2Ba质粒上的翻译融合。在B. garinii G25和B. afzelii IP3中，先导序列与bmpA在框架内，因此在B. afzelii IP3中，bmpA表达为比bmpA分子量更高的蛋白GydF4y2Bab . burgdorferiGydF4y2Ba297和B. afzelii dk7。GydF4y2Ba

领导者;BMPA;翻译调节。GydF4y2Ba

BMP蛋白质是高度保守的蛋白质，没有成熟的功能GydF4y2Bab . burgdorferiGydF4y2BaSensu Lato和免疫原性。据报道，来自该集群的四个基因GydF4y2BaBMPD-BMPC-BMPA-BMPBGydF4y2Ba表达在GydF4y2Ba体外GydF4y2Ba作为单障碍和多排名消息。GydF4y2Ba

本报告中提出了证据，即BMPA mRNA含有分隔的90个碱基对的两个核糖体结合位点（SD）。SD1在小型32氨基酸ORF - 前导肽（BMPAL）之前。SD2是342氨基酸BMPa的RBS。BMPAL和BMPA ORFSGydF4y2BaB.burgdorferiGydF4y2Ba297重叠八个碱基对表明两种蛋白质可以共同调节。在SD2中的前列肽和“-GGG-”中的前五个密码子很少在博尔塞里亚使用，表明它们可以调节BMPAL和BMPA表达。在引导序列中删除SD1，或在SD2之前立即引入止挡密码子，以增加包含的B.Burgdorferi 297中的BMPA :: GFP表达式GydF4y2BabmpA:绿色荧光蛋白GydF4y2Ba质粒上的翻译融合。在B. garinii G25和B. afzelii IP3中，先导序列与bmpA在框架内，因此在B. afzelii IP3中，bmpA表达为比bmpA分子量更高的蛋白GydF4y2Bab . burgdorferiGydF4y2Ba297和B. afzelii dk7。GydF4y2Ba

领导者;BMPA;翻译调节。GydF4y2Ba

包柔氏螺旋体burgdorferiGydF4y2Ba，螺旋细菌导致虱子感染称为莱姆病[1,2]。GydF4y2Bab . burgdorferiGydF4y2Ba基因组包含约1000个染色体和400个质粒基因[3]，但只有少量的调控基因、sigma因子和一个rho终止因子[3]的同源物。此外，伯氏疏螺旋体的基因和基因家族与其他细菌[3]的基因不具有同源性，提示伯氏疏螺旋体可能具有不同的基因表达调控机制。GydF4y2Ba

进化选择的毒力基因调控系统允许基于宿主生态位的时间和特殊要求的协调基因表达。毒力基因的全局调控是病原菌克服固有宿主防御复杂性的常用策略[4-11]。除了全球调控系统外，原核生物还可以采用非全球致病基因调控机制。包括非编码rna的表达[12,13]，对mRNA二级结构的影响，形成终止子/抗终止子结构[14-16]，影响mRNA稳定性[17]和核糖体结合效率差异[18,19]。GydF4y2Ba

这GydF4y2BaBMP.GydF4y2Ba基因集群GydF4y2Bab . burgdorferiGydF4y2Ba位于染色体中，编码具有高氨基酸同源的脂蛋白，其在体内表达并是免疫原性的[20-22]。在人类和动物抗体中，针对这个家庭中的一个成员，BMPA（以前P39），在感染期间早期出现[21]。GydF4y2Bab . burgdorferiGydF4y2Ba和GydF4y2BaBMPA或BMPB.GydF4y2Ba删除无法持续在小鼠联合组织[23]中。BMPA还可以刺激人和鼠淋巴细胞中炎性细胞因子的产生，表明BMPA在维持哺乳动物感染方面的重要作用[23]。GydF4y2Ba

根据Dobricova等人[24]，4GydF4y2BaBMP.GydF4y2Ba基因在体外表达，并构成两个转录单位，具有复杂的转录模式，包括可选的单顺反子和多顺反子信息。一个单元包含bmpD，第二个单元包含bmpC、bmpA和bmpB。此外，在bmpD、bmpC和bmpA中发现了启动子，但在bmpD中未发现启动子GydF4y2BaBMPB.GydF4y2Ba．这GydF4y2BaBMPCGydF4y2Ba始终表达为具有BMPA的多函数信息，BMPA可以作为单独的mRNA转录和作为双顺声GydF4y2BabmpAbmpBGydF4y2Ba．根据Ramamoorthy等人。[25]来自BMPA-BMPB操纵子的表达导致三种不同的转录物BMPA，BMPA-BMPB和BMPA截短GydF4y2BaBMPB.GydF4y2Ba．此外，burgdurferi sensu lato复合体中bpm基因的保存和同源性的存在GydF4y2Ba密螺旋体属GydF4y2Ba钯和许多其他细菌表明这些蛋白质可以起到基本的生理作用。GydF4y2Ba

不寻常的基因结构BMP基因和其表达的图案可能表明参与这些基因表达的特定调节机制。要揭示关于BMPA表达和监管的一些问题，我们调查BMPA成绩单和领导序列的作用（GydF4y2BabmpAGydF4y2Ba_L.GydF4y2Ba）关于BMPA表达。GydF4y2Ba

大肠杆菌GydF4y2BaDH5α（新英格兰Biolabs，Beverly，MA）和大肠杆菌Top10在Luria-Bertani（LB）肉汤或板（Gibco-Brl，Gaithersburg，MD）中生长。这GydF4y2Bab . burgdorferiGydF4y2Ba279 [26]以6％兔血清（Sigma，St.Louis，Mo）生长在BSK-H中等（Sigma，St.Louis，Mo）中生长。指定时加入适当的抗生素。GydF4y2Ba

DNA操作GydF4y2Ba采用标准方法[27]。限制性内切酶从新英格兰生物实验室(New England BioLabs)中获得。使用High Pure PCR Template Preparation kit (Roche, Mannheim, Germany)从细菌培养物中纯化总DNA，使用QIAquick Gel Extraction kit (Qiagen, Valencia, California)进行DNA片段和PCR产物纯化;所有的方法都是按照制造商的说明进行的。用长PCR方法构建[28]。本研究中使用的寡核苷酸引物购自伊利诺伊州斯科奇市的整合DNA技术公司。所有构建物均经适当引物PCR扩增确认(表1)，并对扩增物进行DNA序列分析。GydF4y2Ba

构建GFP融合的策略如图1所示。不同的长度GydF4y2BabmpAGydF4y2BamRNA序列被扩增GydF4y2Bab . burgdorferiGydF4y2Ba297个DNA，包含基因特异性的正向引物P1，该引物从翻译起始密码子上游经过至少190 bp的处理，以融合本地启动子，并包含一个包含特定限制性内切酶(RE)位点的连接子，以促进克隆。引物P1与反向引物P2配对，其中包含一个25 ~ 30 bp的连接子GydF4y2BaGFP.GydF4y2Ba．用引物P3从PCE320 [29]中扩增的GFP，其包括特定BMPA序列和引物P4的25至30bp，其包括内框架的终止密码子和另一个RE位点。GydF4y2Ba

删除的SDGydF4y2Ba_1GydF4y2Ba或SDGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba引物中引入终止密码子和前导序列突变，通过PCR将终止密码子和前导序列突变引入构建物中。首先创建包含SDs且没有突变的结构体，然后作为模板生成如上所示的结构体。GydF4y2Ba

表1中列出了用于扩增GFP和单个BMPA序列的引物。为了产生融合构建体，使用P1和P4引物混合并扩增每个BMPA片段或突变体和GFP扩增子。GydF4y2Ba

本工作中所有构建物的PCR扩增参数如下:变性在94°C 2分钟为一个周期,紧随其后的是38个周期94°C的10年代,53°C 10 s, 2分钟72°C,并最终在68°C扩展5分钟。由此产生的PCR产物纯化和克隆成pCR2.1-TOPO随后electroporated大肠杆菌全球。用卡那霉素或氨苄西林(根据生产说明书)在Luria-Bertani琼脂平板上筛选电致孔质粒，纯化质粒DNA。然后将每个构建体切除并亚克隆到pKFSS1[30]中。所有结构中含有克隆结构的DNA片段均通过DNA测序得到证实。GydF4y2Ba

所有建筑都位于本地GydF4y2Bab . burgdorferiGydF4y2Ba297 BMPA启动子并含有不同长度的BMPA mrnasequnse。构造GydF4y2BaBMPAL :: GFP.GydF4y2Ba在该起始密码子下含有来自-190碱基对（BP）的mRNA BMPA序列到BMPA起始密码子（-Aug-）和GFP。结构体GydF4y2BaBMPAL（ΔSD1）:: GFPGydF4y2Ba和GydF4y2BaBMPAL（ΔSD1）:: GFPGydF4y2Ba通过删除SD1（-GTGGAG-）和SD2（-AgGGGA-）与第一个不同。在建筑中GydF4y2BabmpAL (33 bpbmpa):: gfpGydF4y2Ba，GFP分别在33 bp的BMPA基因后开始，并在GydF4y2BaBMPAL SD1 :: GFPGydF4y2BaBMPAL启动密码子-uug-后，包含GFP的启动。在里面GydF4y2BaBMPAL停止:: GFPGydF4y2Ba，GFP在领导者肽止芯密码子后融合。GydF4y2Ba

这GydF4y2Bab . burgdorferiGydF4y2Ba电穿孔。GydF4y2Bab . burgdorferiGydF4y2Ba297在半志阶段（1-2 x 10GydF4y2Ba^7.GydF4y2Ba用10至30μg重组质粒DNA电冷却细胞/ ml）。过夜回收后，将细胞稀释至107个细胞/ mL，并分布到96个微孔板（康宁，N.Y。）中，含有70-100μg/ ml链霉素的BSK-H培养基，用于选择含有重组质粒的克隆。10-15天后DNAGydF4y2Bab . burgdorferiGydF4y2Ba在这些微孔中生长的细胞通过荧光和PCR检测质粒的存在。使用高纯PCR模板制备试剂盒(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)提取链霉素耐药菌种的DNA，并通过PCR分析是否存在具有特定引物的合适结构(表1)。GydF4y2Ba

大肠杆菌DH5α和GydF4y2Bab . burgdorferiGydF4y2Ba从1-2×10中提取297总蛋白质GydF4y2Ba^7.GydF4y2Ba通过在Laemmle缓冲液中裂解它们来细胞/ mL。通过SDS-PAGE分析蛋白质裂解物，然后通过兔抗GFP（Invitrogen，Eugene，Oregon，USA）或抗BMPA多克隆抗体进行银染色或免疫印迹。根据制造商的说明（Amersham Biosciences，Piscataway，N.J.），使用ECF Western Blotting套件开发免疫印迹，并使用Storm 860磷仪和ImageQuant软件（Molecular Dynamics，CA）检测。GydF4y2Ba

来自三个独立实验的等分试验，在OD中含有大肠杆菌GydF4y2Ba_06GydF4y2Ba= 08和1x10GydF4y2Ba^8.GydF4y2Bab . burgdorferiGydF4y2BaB31及其在PKFSS1或TOPO中含有GFP的衍生物用PBS洗涤，并在FACS扫描流动筛分（Becton Dickinson，Mountain Lake，Calif）上分析使用CellQuest 3.2（Becton Dickinson）。GydF4y2Ba

大肠杆菌的培养物和GydF4y2Bab . burgdorferiGydF4y2Ba用荧光显微镜检测不同结构的279个细胞(106个/ml)的荧光。GydF4y2Ba

bmpA基因的转录起始位点相对于其翻译起始密码子位于-105bp位置，位于bmpC基因的编码序列内(bmpC终止密码子上游60个碱基)。GydF4y2Ba

存在于BMPAL存在的几个回文序列，表明BMPAL还可以形成复杂的二级结构和两个嘌呤达区域，其可以用作核糖体结合位点（RBS）[31-33]。此外，领导肽和BMPA的ORF可以形成两个不同的框架并含有BMPA的止芯密码子GydF4y2Ba_L.GydF4y2Ba这可以与BMPA的起始密码子重叠（图2A），表明这两种蛋白质可以共同表达并共调节。将突变引入回文中，以至于它们改变mRNA二级结构但不影响氨基酸序列，不影响BMPAGydF4y2Ba_L.GydF4y2Ba和BMPA表达式（未显示数据）。GydF4y2Ba

瑞典民主党GydF4y2Ba_1GydF4y2Ba序列为- ggag，在SD之间有空格GydF4y2Ba_1GydF4y2Ba和从SD中的第一个g计数的10bp的启动密码子-uugGydF4y2Ba_1GydF4y2Ba(图2)。SD之间的间距GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba（-Agggga-）和发起密码子 - 从SD中的第3位从第二个G计计算12bpGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba(图2)。bmpA mRNA中的两个SDs均可与16S rRNA的3 '端配对(图2B)[31]，提示两个SDs均可与16S rRNA的3 '端配对(图2B)GydF4y2Ba_S.GydF4y2Ba可以是功能的GydF4y2Bab . burgdorferiGydF4y2Ba．GydF4y2Ba

对BMPA基因的仔细序列分析显示出两个潜在的SD的存在GydF4y2Ba_S.GydF4y2Ba．第一个SDGydF4y2Ba_1GydF4y2Ba(- ggag -)从转录起始密码子的核苷酸位置+4开始计数，接近另一个起始密码子- uug -。该序列(- ggag -)是许多种细菌的经典SD序列，在PubMed数据库中检索到的伯氏疏螺旋体约43%的基因中发现了该序列。GydF4y2Ba

（-GGAG-）与BMPA的翻译开始密码子之间的距离为100bp。SD间距，SD与发起密码子之间的距离，SD序列的变化以及其他替代翻译起始位点的效果进行了很好地研究。SD和发起密码子之间的过长或间距短，可以取消或限制有效的翻译启动[34,35]。GydF4y2Ba

第二SD（-AgGGGA-）位于从所述翻译开始密码子的+1和14个核苷酸计数的核苷酸位置90 - 用于BMPA。sequence -aggggga-与sd不太常见，并且不会在数据库中显示为sd序列GydF4y2Bab . burgdorferiGydF4y2Ba．而且，两个预测的SDGydF4y2Ba_S.GydF4y2Ba可以用16s rrna削减（图2b）。GydF4y2Ba

为了验证- ggag -或- agggga -是BmpA的SD，我们制作了几种仅在BmpA中不同的结构GydF4y2Ba_L.GydF4y2Ba．其中一种含有bmpA促进剂bmpAGydF4y2Ba_L.GydF4y2BabmpA的翻译起始密码子- aug -与gfp (bmpAGydF4y2Ba_L.GydF4y2Ba:: GFP）。第二秒仅不同于SD2（-AgGGGA-）序列中的删除（（BMPAL（ΔSD）GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba）:: GFP），第三构造包含删除SD1（-GGAG-）序列（BMPAL（ΔDGydF4y2Ba_1GydF4y2Ba）:: GFP）。在大肠杆菌中研究了GFP的表达，其用作模型微生物以及B.burgdorferi菌株297。GydF4y2Ba

流式细胞术分析结果如图3所示。在患有BMPA的质粒中GydF4y2Ba_L.GydF4y2Ba（ΔD.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba）:: GFP（图3.第2行）大肠杆菌荧光和GydF4y2Bab . burgdorferiGydF4y2Ba未检出菌株。相反，SD1的缺失并没有消除GFP的表达(图3)。line 3)，并且在大肠杆菌中GFP的表达水平与包含两个SD位点的构建物bmpAL:: GFP相同。同时，在b.b burgdirferi 297中，GFP的表达量比构建物bmpAL:: GFP的表达量高约两倍。这一数据表明- agggga -确实是BmpA的SD位点。此外，事实是，双方SDGydF4y2Ba_S.GydF4y2Ba（-GGAGAND -AGGGGA-）可以与B.Burgdorferi的16S RRNA的3'末端配对，并且可以形成翻译发起区域（SD，发起者密码子和间隔区），表明SDGydF4y2Ba_S.GydF4y2Ba可以有效（图2a，2b）。GydF4y2Ba

为了验证SD1（-GGAG-）可以与-uug-一起形成翻译启动区域（TIR），我们构建了质粒，其中GFP与第一个起始密码子--uug-之后预测的SD1-（-GGAG-）（图3。第4行）。该质粒允许从起始密码子的GFP产生，用于在天然BMPA启动子（PBMPA）的控制下仅当 - 称为SD SATE和-uug-作为起始密码子的角色。在大肠杆菌中研究了来自该构建体的GFP的表达GydF4y2Bab . burgdorferiGydF4y2Ba并与含有两种SDs的质粒中GFP的表达进行比较(图3)。1行)。GydF4y2Ba

流式细胞仪分析显示GFP在大肠杆菌和大肠杆菌中表达GydF4y2Bab . burgdorferiGydF4y2Ba从含有GFP的质粒到前导肽的起始密码子。western blotting检测了该构建物中GFP的表达(数据未显示)。这表明BmpAL是由- uug -起始密码子以- ggag -为SD翻译而来的GydF4y2Ba_1GydF4y2Ba．低表达可能与早期使用的起始密码子- uug -有关。GydF4y2Ba

为了检测前导肽表达对BMPA表达有任何影响，我们创建了含有PBMPA，BMPA的构建体GydF4y2Ba_L.GydF4y2Ba， 33 bp bmpA在框架内与gfp蛋白融合。第二个构建是通过删除与SD1 (bmpA)相对应的序列- ggag -而建立的GydF4y2Ba_L.GydF4y2Ba（ΔD.GydF4y2Ba_1GydF4y2Ba）33bpbmpa :: GFP）。GFP的表达在大肠杆菌中显着高得多GydF4y2Bab . burgdorferiGydF4y2Ba包含SD的菌株GydF4y2Ba_1GydF4y2Ba删除(bmpAGydF4y2Ba_L.GydF4y2Ba（ΔSD1）33bpbmpagfp）与含有SDS BMPA的菌株相比GydF4y2Ba_L.GydF4y2Ba33bpbmpAgfp构造(图4A, 4B)。GydF4y2Ba

b . burgdorferiGydF4y2BaBMPA单闭声信息包含两个SDGydF4y2Ba_S.GydF4y2Ba．SD的事实GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba在SDGydF4y2Ba_1GydF4y2Ba，表示SDGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba不翻译成SDGydF4y2Ba_1GydF4y2Ba而在SD的情况下，表达水平升高GydF4y2Ba_1GydF4y2Ba与包含两个SD的构造进行了比较GydF4y2Ba_S.GydF4y2Ba建议BMPA的翻译GydF4y2Ba_L.GydF4y2Ba抑制BMPA翻译（图3和图4）。在大肠杆菌菌株中未检测到这种效果，并且可以通过较强的16SRNA配对和SD进行解释GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba与SD相比GydF4y2Ba_1GydF4y2Ba(图3 b)。GydF4y2Ba

为了验证前导肽的终止密码子是否在上游定位基因的调控中起作用，我们构建了一个包含完整bmpA的结构GydF4y2Ba_L.GydF4y2Ba包括在BMPA基因的框架中融合的终止密码子和GFP（BMPAGydF4y2Ba_L.GydF4y2Ba停止::gfp)。流式细胞仪检测了GFP的表达(图3)。终止密码子的存在显著抑制了GFP的翻译，与构建时相比，将GFP直接融合到bmpA的起始密码子上。此外，正如我们所预料的，根据核糖体与SD在大肠杆菌和伯氏疏螺旋体中的配对，与大肠杆菌相比，在伯氏疏螺旋体中的作用更明显，提示BmpA的终止密码子GydF4y2Ba_L.GydF4y2Ba在BMPA基因表达中起着重要作用。GydF4y2Ba

我们还引入了止芯密码子在引导肽内（图4.构造3）。Western印迹分析显示仅在大肠杆菌中的这种构建体中GFP的表达，而不是在B.burgdorferi（图4b）中。GydF4y2Ba

因此，我们的结果表明SDGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba不翻译成SDGydF4y2Ba_1GydF4y2Ba通过次要结构，来自SD的翻译GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba不需要SDGydF4y2Ba_1GydF4y2Ba，以及SD的翻译GydF4y2Ba_1GydF4y2Ba禁止从SD翻译GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

B.burgdorferi Orf为BMPAGydF4y2Ba_L.GydF4y2Ba用分子量3882.67道尔顿编码32个氨基酸领导肽。它含有三种强碱（+）氨基酸（K，R），两个强酸性（ - ）氨基酸（D，E），14个疏水性氨基酸（A，I，L，F，W，V）和十个极性氨基酸（N，C，Q，S，T，Y）。该肽的等电点为8.178,1.044，在pH7.0时电荷。BMPAL的核苷酸序列含有％A + T = 76.77％C + G = 23.23％，其中％a = 36.36;％g = 16.16;％t = 40.40;％c = 7.07。GydF4y2Ba

BMPAGydF4y2Ba_L.GydF4y2Ba氨基酸序列表现出与其他物种的博洛斯领导肽的强烈相似，但我们没有对另一种细菌领导肽的同源性。前19个氨基酸是强保守的（图5）。在这个保守派区域内部，位于5 leu Codons和3个人中，很少在博福雷斯使用，这表明他们可以发挥监管作用。GydF4y2Ba

此外，BMPAGydF4y2Ba_L.GydF4y2Ba氨基酸序列在博尔塞尔物种之间也具有显着差异。GydF4y2Bab . burgdorferiGydF4y2Ba菌株297、N40、B31、BL206具有保守的32个氨基酸先导肽，终止密码子位于bmpA起始密码子之后的两个核苷酸。B. bissettii 25015和B. andersonii 21038也有32 bp的前导肽，但在可变区氨基酸不同。GydF4y2Ba

b . burgdorferiGydF4y2Bash - 2 - 82和GydF4y2Bab . burgdorferiGydF4y2BaBTO1具有较短的28-氨基酸肽。B. afzelii pko和b. garini pbi具有24个领导肽，B. afzelii Ip3或b. garini g25在框架中具有bmpa的领导肽。该数据可能提示BMPA调节和表达中的应变 - 抑制差异。例如，B. afzelii IP3或B.Garini G25可以使用SD1或SD2来表达BMPA。它可以包含两个具有和没有领导序列的BMPA产品。在菌株中的相同驯服表达BMPAGydF4y2Bab . burgdorferiGydF4y2Bash - 2 - 82,GydF4y2Bab . burgdorferiGydF4y2BaBTO1，B. AFZELII PKO和B. Garini PBI可以从SD开始重新加入ORFGydF4y2Ba_1GydF4y2Ba．如果这些现象具有生物重要性，则目前尚不清楚。GydF4y2Ba

将两个框架突变引入BMPAGydF4y2Ba_L.GydF4y2Ba检查BMPAL在BMPA翻译中保守和可变部分的作用。第一两点突变在BMPAL 4AA和16AA之间改变氨基酸序列。GFP在得到的突变体中的表达与野生型BMPA不同GydF4y2Ba_L.GydF4y2Ba．在相同的驯服中，可变部分的氨基酸序列的变化（缺失-A-在密码子20）显着增加了GFP表达（图6）。而且，在这种情况下，BMPAGydF4y2Ba_L.GydF4y2Ba与伯氏疏螺旋体Sh-2-82相似，终止密码子位于SDGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba，表示在SD处的平移GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba可以从SD启动的ORF重新启动吗GydF4y2Ba_1GydF4y2Ba

基于上述结果，我们提出了一个类似于e.c oli[36,37]和包含上游ORFs[38]的真核蛋白编码基因的模型(图7)。在菌株297中，核糖体从SD开始GydF4y2Ba_1GydF4y2Ba，它然后覆盖SDGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba，所以SDGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba在B. afzeliiPKo, B. garini PBi, B. burgdorferi BTO1中，核糖体可以从SD开始从ORF重新启动翻译GydF4y2Ba_1GydF4y2Ba(B).在B. garini G25中，B. afzelii IP3 SD2前导肽与bmpA基因在框架内融合。在这种情况下，两种产品是可能的。一种含有BmpA蛋白和前导肽，另一种只含有BmpA蛋白。为了验证这一假设，我们对其进行了western blottingGydF4y2Bab . burgdorferiGydF4y2Ba297，N40和B. afzelii IP3（图8）。数据表明B. afzelii的BMPA与BMPA相比略大略大GydF4y2Bab . burgdorferiGydF4y2Ba297和N40，确认我们的假设。GydF4y2Ba

含有两个SD的构造的平移水平较低GydF4y2Ba_S.GydF4y2Ba比较Wit包含仅包含SD的相同构造GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba可以通过bmpa解释GydF4y2Ba_L.GydF4y2Ba顺序。前四个密码子是罕见的GydF4y2Bab . burgdorferiGydF4y2Ba，表明核糖体可以转化该区域较慢。另一个事实，保守区域内部的领导肽含有五种亮氨酸（Leu），密码子和其中三个很少用于GydF4y2Bab . burgdorferiGydF4y2Ba，建议他们可以参与引导肽表达的调节。而且，另一个罕见的密码子-ggg-GydF4y2Bab . burgdorferiGydF4y2BaBMPAL位于SDGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba区域，可以减缓核糖体运动，覆盖SDGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba抑制聚合的第二核糖体和来自SD的翻译GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba．我们还不排除额外的RNA结合因子或5'RNA的二级结构也可能在引导肽表达的调节中起作用。GydF4y2Ba

基因表达后的转录调节是一种关键机制，细胞和生物可以响应内部或外部刺激而迅速改变它们的基因表达。所有基因的表达在包括mRNA稳定性的多个转录后步骤中调节，以及mRNA的翻译。起始步骤的平移调节可以通过在5'RNA领导序列中存在的不同顺式作用元件介导，例如5'RNA的二级结构和上游开放读数框架（UORF）。通过干扰下游ORF的翻译引发效率，可以显着改变蛋白质表达水平[38,39]，表明它们可以控制蛋白质合成。GydF4y2Ba

综上所述，这些数据表明bmpA mRNA中存在两个翻译起始区。瑞典民主党GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba仅在SD时才有效GydF4y2Ba_1GydF4y2Ba是沉默。位于30S核糖体亚基的16S rRNA在翻译起始位点的选择中起着重要作用[32,33]。在大多数mRNA中，4或5 bp的SD相互作用足以介导有效的翻译[40]。然而，当起始密码子不是- aug -或起始位点被二级结构[41]掩盖时，比常规SD相互作用更强的SD相互作用确实有帮助。形成不稳定二级结构的A/U丰富的起始位点可能不需要SD相互作用。GydF4y2Ba

强大的SD基础配对GydF4y2Ba_1GydF4y2Ba具有16S rRNA（8bp）的序列与SD相比GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba（5 bp）GydF4y2Bab . burgdorferiGydF4y2Ba（图2B）表明核糖体应在SD中更有效地聚合GydF4y2Ba_1GydF4y2Ba．在大肠杆菌中，将16s与SD配对16sGydF4y2Ba_1GydF4y2Ba和SDGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba相应地是4和6 BP相反。这一事实表明，在大肠杆菌中，核糖体在SD中更有效地聚合GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba．-uug-在大肠杆菌中使用大约3％的起始密码子，并且它也是一个罕见的起始密码子GydF4y2Bab . burgdorferiGydF4y2Ba．可以通过在FMET-TRNA中与抗助谐（-UAC-）配对来优选 - 起始密码子。较弱的配对是 - 当 - 或-uug-用作起始密码子时的效率较低的翻译的一部分。在来自这些密码子的大肠杆菌翻译中，效率低于-aug-[43]。因此，即使是SDGydF4y2Ba_1GydF4y2Ba有更多的基础与16s rrna配对GydF4y2Bab . burgdorferiGydF4y2Ba通过使用-uug-作为起始密码子来减少BMPAL的翻译。GydF4y2Ba

许多细菌基因是多函数操纵子的一部分[44-47]。翻译偶联和重新启动对于来自多函数操纵子的功能相关蛋白质的表达是重要的[48,49]。一些翻译耦合消息的传感器没有独立的SD，并且在这种情况下，上游Cistron的终止密码子和下游Cistron重叠的发起者密码子。第一肽的止乳纤维组中的功能性核糖体能改变下游Cistron的翻译而不是拆卸。从第一Cistron翻译的缺陷废除了来自下游Cistron [50]的翻译。GydF4y2Bab . burgdorferiGydF4y2BabmpA转录为包含两个SDs的单顺反子mRNA，并与bmpCbmpA和bmpAbmpB转录为多顺反子。删除记忆GydF4y2Ba_1GydF4y2Ba从该mRNA中增加GFP或BMPA在大肠杆菌中的翻译GydF4y2Bab . burgdorferiGydF4y2Ba建议SDGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba不翻译成SDGydF4y2Ba_1GydF4y2Ba通过二级结构(图3、4、6)。GydF4y2Ba

核糖体的大小为25nm，表明一个核糖体可能占据大约10- 20aa[51]的空间。当核糖体从SD开始翻译时GydF4y2Ba_1GydF4y2Ba，另一个核糖体有足够的空间从SD聚合和转译GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba．但在没有翻译终止的情况下，SD的核糖体GydF4y2Ba_1GydF4y2Ba向前移动并覆盖SD的核糖体聚合所需的区域GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

延伸的核糖体通过ORF翻译的速率是密码子特异性的，在大肠杆菌中，每秒钟有5-21个密码子。核糖体在稀有密码子或终止密码子的翻译伸长过程中可能会出现停顿，从而阻碍核糖体的添加。核糖体延迟也参与翻译的正调控[51-53]。GydF4y2Ba

领导者中的前四个氨基酸是稀有密码子，可以有效地从SD调节平移GydF4y2Ba_1GydF4y2Ba．当核糖体占据Leu的两个引导密码子时，核糖体逐渐侵占第二核糖体在SD2处引发的空间。事实上，BMPAGydF4y2Ba_L.GydF4y2Ba含有在伯氏杆菌中使用效率较低的密码子，这也可能是bmpA翻译较慢的原因GydF4y2Ba_L.GydF4y2Ba．最后，BMPA可变部分中Cys（-ugu-）的稀有密码子GydF4y2Ba_L.GydF4y2Ba和gly（-gggg-）在SD内GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba以及BMPAGydF4y2Ba_L.GydF4y2Ba停止密码子是导致SD核糖体翻译变慢的原因GydF4y2Ba_1GydF4y2Ba干扰SD的第二核糖体聚合GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba[53]。GydF4y2Ba

当在衍生质粒中存在与止芯密码子一起的天然BMPAL时，大肠杆菌中的GFP表达显着低，并且在低水平上未检测到或检测到GydF4y2Bab . burgdorferiGydF4y2Ba与没有终止密码子的类似构造进行比较（图3）。来自构造的GFP翻译（图6），其中终止密码子位于SD之前GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba与含有天然BMPA的构建体的翻译相比，显着高得多GydF4y2Ba_L.GydF4y2Ba(图7)而且，这个构造的aa序列让人想起了a的序列GydF4y2Bab . burgdorferiGydF4y2BaSH-2-82和GydF4y2Bab . burgdorferiGydF4y2BaBTO1。这一数据表明，从SDGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba可以从头开始或从SD重新启动GydF4y2Ba_1GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

莱姆病患者，有伯氏疏螺旋体感染，表现出从无症状感染到慢性关节炎的各种临床证据。感染最常见的临床症状是移行性红斑，由皮肤伯氏疏螺旋体感染引起[54,55]。约5%未经治疗的患者会发展为心肌炎(如心脏传导阻滞)，约10%会发展为神经系统表现，如脑膜炎、脑神经麻痹或神经根病，约60%会发展为关节炎[54]，约20%的患者不会产生任何后续临床表现。患者临床指标的差异性可能是由于个体差异或菌株间差异造成的GydF4y2Bab . burgdorferiGydF4y2Ba会引发感染。菌株的GydF4y2Bab . burgdorferiGydF4y2Ba可以基于各种键入方法分类为子类型。越来越多的证据表明某些亚型更可能导致血管传播比其他亚型[56]更容易引起血源性传播[56]。BMPA可以从三个独立的转录物BMPA，BMPabMPB和BMPCBMPA表达的那些事实，并且该领导肽位于BMPA转录物前并可调节BMPA翻译，表明BMPA表达的差异可参与毒力应变多样性。GydF4y2Ba

本出版物所使用的数据可根据要求从通讯作者处获得。GydF4y2Ba

没有利益上的冲突。GydF4y2Ba

Autor非常感谢Cabello博士给他机会作为一个独立的研究项目来进行和发表这项研究。GydF4y2Ba