作品简介:隐球菌病是一种真菌机会性感染，在免疫功能低下的患者中被广泛诊断。降低对常用抗真菌药物的敏感性是值得关注的。在George Mukhari博士所服务的社区(DGMT-Laboratory)没有实验室。

方法:采用E-test方法检测是否出现对氟康唑、伏立康唑和两性霉素b敏感性降低的分离株。采用多重聚合酶链反应(PCR)方法进一步鉴定在George Mukhari博士三级医院(dggmt -医院)流行的血清型。

结果:e检验条带被解释为与所鉴定的每种血清型相关的耐药性、中间型或易感型。检测的50株分离株中，100%被伏立康唑和两性霉素b抑制。氟康唑对50%的分离株有耐药性。

结论:c . neoformansDGMT-Laboratory服务地区以A型为主，占分离株的96%。持续监测耐药性的出现对公共卫生具有重要意义。

隐球菌病,血清型

作品简介:隐球菌病是一种真菌机会性感染，在免疫功能低下的患者中被广泛诊断。降低对常用抗真菌药物的敏感性是值得关注的。在George Mukhari博士所服务的社区(DGMT-Laboratory)没有实验室。

方法:采用E-test方法检测是否出现对氟康唑、伏立康唑和两性霉素b敏感性降低的分离株。采用多重聚合酶链反应(PCR)方法进一步鉴定在George Mukhari博士三级医院(dggmt -医院)流行的血清型。

结果:e检验条带被解释为与所鉴定的每种血清型相关的耐药性、中间型或易感型。检测的50株分离株中，100%被伏立康唑和两性霉素b抑制。氟康唑对50%的分离株有耐药性。

结论:c . neoformansDGMT-Laboratory服务地区以A型为主，占分离株的96%。持续监测耐药性的出现对公共卫生具有重要意义。

隐球菌病,血清型

隐球菌病是威胁生命的主要机会性感染之一。该疾病是由新生隐球菌(c . neoformans),gattii隐球菌(C. gattii)，这在免疫缺陷患者[2]中被广泛诊断。以新型C. neoformans为主，有3种血清型，即A型、D型和hybrid-AD[3]。以前，这些血清型是通过表型方法[4]鉴定和区分的。最近用PCR方法鉴定了[5]。更多的分子检测方法被用于新冠梭菌血清型[6]的分类。这种分类是基于多糖胶囊中与毒力因子相关的抗原变态[3,7]。在全球范围内流行的是血清型A，而血清型D和AD杂交的传播数量被截断[1-3]。由于艾滋病毒/艾滋病的异常发生，南非隐球菌病的90%以上病例为A血清型[2,8-10]。

治疗隐球菌病最常用的抗真菌药物有两性霉素b、氟胞嘧啶、伏立康唑和氟康唑[9,11]。两性霉素b被用作一线治疗，但由于毒性的限制，需要进行实验室监测，伏立康唑仅限于非洲的私营部门[9-12]。推荐联合使用抗真菌药物进行诱导，但在资源贫乏的国家没有氟胞嘧啶。不幸的是，这些国家是隐球菌病高发的国家[10-12]。这些抗真菌药物也受到抗原性多糖胶囊耐受性、交配基因类型、耐酸能力和芽孢转换[12]等耐药性机制的限制。全球有20-58%的隐球菌病耐药报告，其中以氟康唑为重点[8- 10,13,14]。其他隐球菌病抗真菌药出现耐药性的报道未见报道[9,15]。此外，内在耐药机制和获得性耐药机制都与隐球菌以及药物倾向于这种耐药机制有关[12,16-18]。

氟康唑的广泛应用可能导致药敏降低[19,20]。因此，氟康唑耐药性的发展对隐球菌病的治疗是毁灭性的，有必要了解是否存在与伏立康唑的交叉耐药性，这可能是一种替代药物。为更新治疗方案，各机构必须监测其所在地区流行的分离菌的易感性特征的变化。我们在这项研究的目的是鉴定循环血清型和确定隐球菌分离株对氟康唑、伏立康唑和两性霉素- b抗真菌药的敏感性谱送至dggmt - hospital NHLS的临床标本。

伦理考虑:美杜莎研究伦理委员会对伦理进行了分类。从DGMTL和nls管理器中获取隔离的权限进行排序。临床分离物与鉴定物分离以确保保密。

样本大小:采用Epi信息3.5.3版(疾病预防控制中心)计算样本量。本研究所需样本量为50。这是在估计频率为50%，功率为80%，置信区间为95%时计算的。

人口:从实验室的实验室信息系统(LIS)中获取人口统计学数据，包括年龄、性别和临床诊断。

分离物的收集和存储:完成患者管理处理后，即可方便地从实验室采集临床分离物。分离株于2014年2 - 7月逐日采集，直至达到样本量。这些分离物已被nls鉴定为隐球菌，并保存在- 4ºC冰箱中。

亚文化的隔离:按照Govender et al. 2011[9]的描述，在Sabouraud葡萄糖琼脂(SDA)平板上进行传代培养。

隐球菌的确认和鉴定:根据Chayakulkeeree(2007)描述[21]进行革兰氏染色以确认酵母细胞的形态。按照Ogundeji(2013)的描述，使用印度墨水(阴性染色)来验证胶囊[22]的存在。根据Gazzoni(2014)[23]方法，对分离株进行斜位接种脲酶肉汤培养基试验作为确证试验。

磁化率测试:在SDA上进行传代培养后(图1)，根据临床和实验室标准协会(CLSI) 2007年[24]的概要进行药敏检测，并按照Govender等人2011年，2013年的描述[9,25]。

多重PCR的DNA提取和样品制备:按照制造商说明书(Zymo研究组)，使用商业试剂盒(ZR真菌/细菌DNA Mini Prep试剂盒)从临床分离株中提取基因组DNA。该试剂盒已经过优化，用于去除PCR抑制剂和最大限度地回收纯DNA而不受RNA污染。使用“生物液体和细胞悬液”[26]方案从分离株中提取DNA。

引物选择:所用引物由Inqaba Biotechnical Industries (Pty) Ltd、Muckleneuk和Pretoria合成。以a型和D型[27]的交配- α基因和交配- a基因为靶点，设计了血清型特异性引物。瞄准基因确认的引物c . neoformans血清型列于表1。

扩增的基因:用特异性引物对提取的DNA进行检测(表1)。制备了两种主混合物(MM)。试剂从Bioline子午线生命科学公司(UK)获得，每个PCR检测都以无核酸酶水作为阴性对照(Bioline, UK)，由于资金限制，阳性对照不包括在内。MyTaq™HS dna -聚合酶(Bioline, UK)用于PCR反应。

对于每个样品，按照制造商的说明(Bioline, UK)制备50 μl反应MM。

简要:10 μL x MyTaq™HS缓冲液，2个引物各1 μL,5 μL模板，0.5 μL MyTaq™HS dna聚合酶(Bioline, UK) (5 U/μL)， 32.5 μL核酸酶游离水。使用两组MM, MM1中包含α - aa - d引物，MM2中包含a- aa - d引物。0.2 mL PCR管每个包含50 μL置于一个反应中，允许在GeneAmp PCR System 9700 (MTHE 01326 PE Applied Biosystems)热循环器中进行3小时;随后的PCR温度如Saiki(1999)[28]所述。

扩增产物检测:使用0%琼脂糖凝胶(Crystal TBE, Bioline, UK)在100 V下，用溴化乙锭和紫外透光器(gel Doc™EZ System)对所有样品进行电泳40分钟。分子量为1kb的标记物(HyperLadder IV, Bioline, UK)与扩增产物一起使用。使用Gel Doc EZ成形仪拍摄照片副本，记录结果作为血清型-a α、Dα或a -a、D-a基因的代表。预期频带见表1。

捕获的数据:采用Microsoft Excel (Microsoft Office, 2010)对数据进行分析，并对采集的数据进行复核以确保可靠性;Epi信息3.5.3版(疾病控制和预防中心)。描述性统计分析采用ANOVA excel, 2010。对连续变量(如年龄)计算集中趋势和离散度;计算分类数据(如血清型)的频率和比例。

信度、效度和客观性:所有测试都是根据公认的、认可的标准操作程序进行的，如果使用的是商业上可获得的试剂盒，则按照制造商的指示进行。琼脂糖凝胶电泳采用分子大小标记。

研究人口:研究期间(2014年6月至10月5个月)送至dgmt实验室的不同临床标本中收集隐球菌分离株50株。11株(22%)来自血液标本，39株(78%)来自脑脊液。

表2

物种的生化检验:对50株分离菌均进行脲酶斜坡试验。在30°C孵育24小时后，观察颜色变化。从无色肉汤到粉红色肉汤培养基的变化证实了新生梭菌的存在(图2)。

磁化率测试:三种抗真菌药物氟康唑、伏立康唑和双性霉素b E-test试条(法国Marcy l 'Etoile bioMe´rieux S.A)孵育后，按CLSI[24]读结果。最小抑菌浓度(MIC)值读取于生长区域和条带边缘的交点。在完全抑制点(100%)读取两性霉素b，如图3所示，氟康唑和伏立康唑mic均在显著抑制生长点读取，生长下降约80%，如图4和5a-b所示。MIC值记录在数据收集表上。氟康唑和伏立康唑的MIC值按照CLSI更新的M27断点(2013)指南解释，两性霉素B的MIC值按照NCCLS M27指南[24]解释。这些被解释为敏感、中间和抗性。

所有菌株的mic值均已测定。伏立康唑和两性霉素b对所有菌株均敏感，见下表3。

表4

下面的琼脂糖凝胶图显示了琼脂糖电泳的代表结果(图6)。

对用于治疗隐球菌病的抗真菌药物的耐药性在全球都有报道[9,16,29-31]。在非洲，隐球菌病流行病学数据很少，但在南非积累的证据表明，对常用抗真菌药物的耐药性发展显然值得关注[8-10,25]。因此，在不同地理区域监测这些常用抗真菌药物的敏感性是必要的。

目前还没有关于由dgmt -实验室提供服务的社区中引起隐球菌病的流行血清型的数据。这项研究旨在确定南非的dgmt -医院隐球菌的易感性和流行的血清型。

根据我们的研究，对两性霉素b、氟康唑和伏立康唑的敏感性进行了分析;对氟康唑的耐药性是最值得关注的(表3)。

我们发现半数的分离株对氟康唑完全耐药，这并不令人惊讶。我们的结果与不同地理区域的多项研究一致，如塞尔维亚的Arsenijevic等(2014)发现60%的临床分离株[32]耐药，而Favalessa等(2014)在西巴西的[33]患者中发现63%的耐药。此外，南非Govender等人(2011年)和(2013年)的一份报告显示，58%的人对氟康唑具有耐药性[9,25]。

氟康唑耐药是基于c . neoformans作用机理[8,16-18]。导致南非患者中隐球菌病复发的其他因素是治疗途径有限和治疗不足[8-10,25]。

此外，本研究分离的菌株对伏立康唑和两性霉素b高度敏感。我们的研究结果与Arsenijevic等人(2014)[32]、Govender等人(2011)和(2013)的研究结果相似，但均报道对伏立康唑和两性霉素b的敏感性为100%[9,25]。体外试验表明，两性霉素b、伏立康唑和氟康唑之间无交叉耐药性。然而，基于患者的临床结果来评估这一点是很重要的。

不幸的是，根据2013年CLSI更新的M27断点文件，两性霉素b没有断点，因此我们按照NCCLS M27- a指南文件(NCCLS M27- a指南，2000)[24]来解释我们的结果。幸运的是，Govender等人(2011)也指出，由于CLSI断点[9]的缺失，对两性霉素b进行药敏试验存在挑战。

基于分子，我们的研究证实了新型C. neoformans血清型在我们的环境中占主导地位。积累的证据表明，据报道A型血清比其他血清型更有毒性和流行[32-36]。同样，巴西的Lugarini等人(2008年)报告了在全国流行的53%血清型a α-交配基因型[34]。Favalessa等人(2014)在巴西中西部进行的类似研究也报告了血清型A使63%的艾滋病毒/艾滋病患者分离物为[33]。Khayhan等(2013)也证实A型是亚洲Phayoa[35]中最流行的血清型。在我们的研究中，我们没有发现患者的HIV状态。我们的研究是符合系统性回顾研究Litvintseva et al(2011)在非洲国家,进行血清型一个专门报道α交配基因类型占79%的隔离[36],根据我们的研究在南非,血清型最常见的循环血清型在我们的环境中,96%的α-交配基因类型。

此外，我们的研究表明，只有少数菌株被确认为血清型α-交配基因型。这几株病毒来自65岁以上的患者。Durham的杜克大学以前报道过D血清型非常罕见，关于这种血清型[37]的分布的信息很少，而Feretzaki等人(2014)在印度报道说，D血清型需要非常高的接种量才能传播和引起脑膜炎[38]等感染。在南非和我们的研究环境中，没有关于血清型D α-交配基因型分布的信息或数据记录。由于年龄的关系，我们的两名患者可能比其他人的免疫缺陷更严重。此外，根据我们的知识，还没有在南非、比勒陀利亚、dgmt -医院开展关于血清型和交配基因的研究。我们的结果强调了正确治疗隐球菌病的重要性。

c . neoformans在格林尼治实验室服务的地区，A型为主要血清型，占分离株的96%。50%的菌株对氟康唑耐药，100%的菌株对伏立康唑和两性霉素b敏感，表明在体外试验中缺乏交叉耐药性。

该研究存在人口数量少、资金拮据等局限性。然而，由于高氟康唑耐药，该研究建议常规进行氟康唑药敏试验。伏立康唑和两性霉素b的交叉耐药性有待进一步评估。

我们感谢nls对分离物收集的协助，以及VLIR的试剂。

作者声明本文的作者身份和/或发表没有利益冲突。

构思和设计实验:EZ Jiyane。完成实验:EZ Jiyane，分析数据:EZ Jiyane，提供的试剂/材料/分析工具:VLIR, EZ Jiyane;对手稿的写作有贡献:EZ Jiyane;评论手稿:EZ Jiyane, L Nemarude, M Nchabeleng教授。

所有资金均来自该机构。