背景:干细胞治疗心肌梗死(MI)已被广泛研究，但由于干细胞在病变组织中的植入和存活较差，这些研究的临床应用令人失望。在本研究中，在干细胞移植前选择性地将胰岛素样生长因子1 (IGF-1)递送到梗死心肌以改善局部微环境。

方法:采用左前降支结扎法诱导大鼠心肌梗死。心肌梗死术后1周，将含有IGF-1的免疫脂质体经尾静脉注入大鼠，并通过心肌内注射将包膜充质干细胞(MSCs)移植至心肌梗死。左心室分数缩短(FS)作为心脏收缩的指标。

结果:靶向IGF-1和MSCs联合治疗显著改善了治疗后3周的心脏收缩力(FS增加2.5%)，与不治疗(FS减少8%)、单独靶向IGF-1 (FS减少4%)或单独MSCs治疗(FS减少8%)相比。免疫组织化学染色显示，IGF-1单独和IGF-1 + MSCs处理均促进了心肌梗死区域的血管再生。IGF-1 + MSCs处理组的干细胞荧光也比MSCs单独处理组强得多，表明IGF-1处理大大提高了移植干细胞的存活率。

结论:与单独使用IGF-1或干细胞治疗相比，靶向IGF-1和干细胞移植相结合可使心功能得到更大的恢复。这种恢复可能是通过靶向igf -1治疗和随后在受损心肌中植入干细胞来改善干细胞存活来实现的。

干细胞治疗，心肌梗死，IGF-1，免疫脂质体。

背景:干细胞治疗心肌梗死(MI)已被广泛研究，但由于干细胞在病变组织中的植入和存活较差，这些研究的临床应用令人失望。在本研究中，在干细胞移植前选择性地将胰岛素样生长因子1 (IGF-1)递送到梗死心肌以改善局部微环境。

方法:采用左前降支结扎法诱导大鼠心肌梗死。心肌梗死术后1周，将含有IGF-1的免疫脂质体经尾静脉注入大鼠，并通过心肌内注射将包膜充质干细胞(MSCs)移植至心肌梗死。左心室分数缩短(FS)作为心脏收缩的指标。

结果:靶向IGF-1和MSCs联合治疗显著改善了治疗后3周的心脏收缩力(FS增加2.5%)，与不治疗(FS减少8%)、单独靶向IGF-1 (FS减少4%)或单独MSCs治疗(FS减少8%)相比。免疫组织化学染色显示，IGF-1单独和IGF-1 + MSCs处理均促进了心肌梗死区域的血管再生。IGF-1 + MSCs处理组的干细胞荧光也比MSCs单独处理组强得多，表明IGF-1处理大大提高了移植干细胞的存活率。

结论:与单独使用IGF-1或干细胞治疗相比，靶向IGF-1和干细胞移植相结合可使心功能得到更大的恢复。这种恢复可能是通过靶向igf -1治疗和随后在受损心肌中植入干细胞来改善干细胞存活来实现的。

干细胞治疗，心肌梗死，IGF-1，免疫脂质体。

每年有73.5万美国人发生心肌梗死[1]。心肌梗死幸存者复发性梗死的风险增加，年死亡率为5%，这使其成为大多数国家发病率和死亡率的主要原因[2]。心肌梗死发生时，部分心肌得不到足够的血流，导致冠状动脉血管闭塞后的永久性细胞死亡和坏死。由于心肌细胞的再生能力有限，受损的心肌细胞最终会被胶原蛋白等疤痕组织所取代，以防止心脏组织进一步的结构损伤。在临床上，心肌梗死的治疗策略主要集中于血流恢复和病理重塑调节[3]。然而，这些治疗方式最多只能改善症状，并不能再生心肌梗死患者失去的心肌[4]。

非造血骨髓源性干细胞，通常被称为间充质干细胞(MSC)，已被证明可分化为间充质细胞类型，包括肌肉、脑、血管内皮细胞和心肌细胞[5-8]。几项使用MSCs的动物模型研究显示，心肌血管生成和/或梗死组织再生诱导受损的心功能得到改善[9-11]。然而，将MSCs输注到受损心脏的临床试验显示，心肌梗死患者的心功能充其量只能得到边际改善[12,13]。一个可能的原因可能是MSCs的治疗潜力受到其在损伤后环境中的生存能力和植入的限制[14-18]。充满炎症细胞的恶劣微环境，以及对高度依赖氧的心肌细胞缺乏必要的血管系统，都导致了最近使用干细胞重建心肌的尝试结果令人失望[19-23]。因此，如果诸如MSC治疗之类的新策略要取得成功，则必须改善诱导的MSCs的存活和植入。

最近，研究人员证实过表达Akt的基因工程MSCs在体外缺氧条件下具有明显的抗死性[24]，并且在心肌梗死大鼠移植到缺血心肌后，可以防止左心室重构并改善心脏功能[25]。这些结果可能表明，激活PI3k/AKT通路可能通过减少炎症而大大提高移植细胞的存活率[26]。然而，由于PI3k/AKT信号通路的长期激活，这些转基因干细胞可能具有潜在的致瘤性[27]。因此，在移植时暂时激活PI3K/Akt通路是提高MSCs存活的一种有吸引力的治疗策略。PI3K/Akt通路可被多种生长因子和细胞保护因子激活[28]，包括胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)[29]。事实上，最近的一项研究表明，IGF-1促进了心脏干细胞的存活，促进了梗死心肌的再生[30]。然而，由于其副作用和IGF-1在循环中的快速清除[31,32]，靶向给药系统有望提高治疗效果。此前，我们曾报道，我们可以成功地通过抗p选择素结合的免疫脂质体将血管生成药物(VEGF)递送到梗死心肌，从而改善大鼠心功能，并显著增加心肌区解剖血管和灌注血管的数量[33,34]。在本研究中，我们发现在心肌梗死模型中，IGF-1选择性递送到梗死组织可以增强间充质干细胞的存活和移植，并进一步显著改善心功能。

采用冠状动脉左前降支闭塞技术诱导6周龄雄性大鼠心肌梗死。Inc .， Wilmington, MA, USA)，如前所述[33,34]。简单地说，用异氟醚麻醉大鼠，用啮齿动物呼吸机插管和通气(安乐死公司，Allentown, PA, USA)。左冠状动脉前降支被丝扎阻塞。表达GFP的大鼠骨髓源间充质干细胞购自Cyagen (Santa Clara, CA, USA)。S-T段抬高和心电图上出现Q波证实心肌梗死的证据。术后将大鼠随机分为5个实验组:1)假手术组(不结扎开/闭胸)，n = 8只;II)未治疗的心肌梗死(注射生理盐水)，n = 8只大鼠;III) MSC治疗，n = 8只大鼠;IV)靶向递送IGF-1, n = 8只大鼠; V) targeted delivery of IGF-1 + MSC combination treatment, n = 10 rats. Systemic delivery of IGF-1 performed in a separate study has shown that systemic treatment does not result in significant improvements in cardiac function (data not shown). All animal protocols were approved by the Temple University Institutional Animal Care and Use Committee. Buprenorphine was given to the animals before surgery to prevent residual pain during surgery and after surgery to relieve pain and stress during the recover from anesthesia. The animals were then placed on a heating pad and observed every 15 minutes until fully recovered from anesthesia as indicated by the ability to maintain sternal recumbency and moving normally, at which point they were moved back to the cage. After recovering from anesthesia, the animals were observed every 30 minutes for the first 8 hours. After 8 hours, they were checked daily until 7 days post-op and once every other day thereafter for 3 more weeks. Animals that appeared to be in distress or pain (muscle spasm, loss of balance, loss of weight, etc.) during the 4-week observation period were euthanized using an overdose of KCl (2 meq/ kg) injected via the tail vein under gas anesthesia.

如前所述，靶向给药系统由两步过程产生[34,35]。首先，通过溶剂蒸发和成膜法制备IGF-1 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)包封长循环脂体，由50%氢化大豆L-α-磷脂酰胆碱(HSPC)、45%胆固醇、3% 1,2-二硬脂酰- cn -甘油-3-磷酸乙醇胺- n-[(聚乙二醇)2000](DSPE-PEG2000)和2% DSPEPEG-马酰亚胺组成。所有脂质均来自Avanti Polar lipids (Alabaster, Alabama, USA)。其次，抗p -选择素单克隆抗体(由Andrew Issekutz博士提供)与脂质体膜的PEG组分偶联，通过连接物2-亚胺硫代烷的硫代化形成免疫脂质体(Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA)。选择p -选择素作为靶受体是因为它在梗死组织的血管中表达上调[35]。抗体首先在pH 8.0下用2-亚氨基硫代烷(Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA)硫代化。然后将引入的硫醇基团与马来酰亚胺基团偶联在pH 6.5的脂质体DSPE-PEG2000组分上。使用MicroKros中空纤维过滤器(Rancho Dominguez, CA, USA)通过切向流过滤法去除非偶联抗体。先前[33,34]我们已经证明，这种靶向给药系统可以成功地、选择性地将包裹的药物递送到心肌组织。

根据我们之前的研究[33,34]，在心肌梗死诱导一周后，将传代2的MSCs注射到心肌内。简单地说，用注射器将100 μL的MSCs以10000个细胞/μL的浓度等量注射到心肌梗死周围的4个不同部位(每个部位25 μL)，以达到干细胞均匀分布。注射间充质干细胞后，立即通过尾静脉给药含有IGF-1的免疫脂质体(每公斤动物体重1 mL脂质体，10 mM脂质浓度对应200 ng IGF-1/kg动物体重)。相应的，生理盐水组在同一时间点进行生理盐水治疗。仅使用IGF-1的组在心肌梗死后1周立即接受含IGF-1的免疫脂质体注射。骨髓间充质干细胞组在心肌梗死后1周注射骨髓间充质干细胞后立即进行生理盐水治疗。

心肌梗死后4周处死动物，取下心脏进行冷冻切片。简单地说，首先用OCT (Fisher Scientific Co.， Houston, TX, USA)填充心室，然后快速冷冻，以便立即切片或保存在-80°C。样品使用-20°C低温恒温器(Leica CM3050 S, Buffalo Grove, IL, USA)以6 μm厚度切片，并安装在载玻片(Superfrost plus, Fisher Scientific Co, Houston, TX, USA)上进行染色和成像。

CD31蛋白(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)免疫组化染色用于解剖血管的鉴定。血管染色，成像和处理，以计算血管的数量。然后用血管数除以面积计算解剖血管密度。拍摄图像，使用ImagePro软件(Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA)对血管数量进行量化。通过GFP荧光信号鉴定表达GFP的存活MSCs。通过心肌细胞标志物心肌肌钙蛋白T和α-肌动蛋白的免疫染色，鉴定移植骨髓间充质干细胞的命运;α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白用于识别新生血管[36-38]。所有抗体均购自赛默飞世尔科学公司(Rockford, IL, USA)。

使用由ImagePro软件控制的TE200倒置显微镜(Nikon Instruments, Inc.， Melville, NY, USA)和LEP MAC 5000电动平台(Ludl Electronic Products Ltd.， Hawthorne, NY, USA)获得图像。获得抗心肌肌钙蛋白T、抗α-肌动蛋白、抗α-平滑肌肌动蛋白和抗波形蛋白染色的免疫荧光图像，与间充质干细胞荧光图像叠加，测定移植间充质干细胞的活力和分化情况。取CD31染色的亮场图像，在ImagePro中增强以识别aec染色的血管。对每个心脏切片，对正常区和梗死区血管数量进行量化比较。

心肌梗死后1周和4周分别行超声心动图评价大鼠心功能。直接从超声心动图上测量左室分数缩短百分数(FS)、左室舒张末期尺寸(LVEDD)和左室收缩末期尺寸(LVESD)， FS的计算方法为:

心肌梗死后1周FS值小于30%的大鼠被认为是心肌梗死完全发展，因为正常大鼠的FS值通常大于40%。mi后1周和4周FS采用配对t检验，差异有统计学意义。采用单因素方差分析(SNK post - thoc)检验不同治疗组间差异的统计学意义。数据以均数±标准误差(SEM)表示。

左心室分数缩短(FS)是衡量心脏泵血功能的标准指标。心肌梗死后心肌细胞开始死亡，左室壁运动减弱，表现为分数缩短(FS)降低。采用超声心动图测量心肌梗死后1周和4周大鼠的FS。对于假手术的正常大鼠(图1A)，术后1周至4周的FS(通过配对t检验)没有变化(“mean±SEM”的FS: 45.3%±2%至46.4%±2.2%)，术后1周和4周的FS均在正常范围内(超过40%，如粉红色虚点线所示)。然而，心肌梗死后1 - 4周，未经治疗的心肌梗死组心功能明显下降(FS: 22.0%±2.2%至13.2%±1.8%，p<0.01)(图1B)。仅MSC治疗(图1C)或靶向IGF-1单独治疗(图1D)均可显著减轻心肌梗死后第1至第4周的心功能损失(MSC组FS: 25.8%±2.8%至22.7%±2.6%，p<0.05;靶向IGF-1组FS: 28.0%±2.7% ~ 30.3%±3.2%，p<0.05)。靶向IGF-1 + MSCs联合治疗不仅阻止了FS的恶化，而且在MI后第1 ~ 4周显著提高了FS(29.0%±1.7% ~ 35.8%±1.7%，p<0.01)(图1E)。经联合治疗后，10只大鼠中有3只心功能恢复正常，心肌梗死后4周FSs改善至正常水平(40% - 60%)。图2显示了各治疗组之间FS增益的总体比较(FS第4周- FS第1周)。 Likewise, the IGF-1 + MSC combination treatment significantly (p<0.01) increased the heart FS from 1 week to 4 week post-MI compared with untreated group. Single treatment of targeted IGF-1 also increased the FS significantly (p<0.01) compared with untreated group, but not as much as the combination treatment did. Single treatment of MSCs delayed FS deterioration compared with untreated MI. From previous studies, independent histological examination by Dr. Stanley D Kosanke from the University of Oklahoma Health Sciences Center confirmed that there was no inflammatory response in major organs after targeted delivery of immunoliposomes (34).

采用CD31/AEC染色定量解剖血管密度。CD31染色图像直接反映心肌区解剖血管的密度和大小。心肌梗死后心肌细胞开始死亡，左室壁变薄，解剖血管密度也明显下降(图3)。由于不同心脏解剖血管密度不同，但同一心脏解剖血管密度不变[33,34]。我们通过计算每个心脏样本心肌梗死区血管密度与同一样本非心肌梗死区血管密度之比，对血管密度进行归一化处理(图4)。对于非心肌梗死大鼠(图4A)，高密度血管均匀分布在左心室，且每条血管的大小较小。未经治疗的心肌梗死组的血管密度变得极低(图4B)，而与正常大鼠相比，每条血管的大小都变大了。与未治疗的心肌梗死组相比，MSCs治疗(图4C)略微增加了血管密度。靶向IGF-1治疗(图4D)与未治疗的心肌梗死组相比，血管密度略有增加，但每条血管的大小增大。IGF-1 + MSC联合处理(图4E)显著增加了血管密度，并使各血管的大小保持在合理的水平(更接近正常)。图5为各治疗组解剖血管数量的定量测量，将心肌梗死区解剖血管数量除以心肌梗死后4周同一心脏右心室解剖血管数量进行归一化处理，以消除动物间的差异。如图5所示，靶向IGF-1处理和靶向IGF-1 + MSC联合处理均显著增加了血管密度。 Compared to the untreated MI group, transplantation of MSCs alone resulted in slight but not a significant increase in the density of anatomical vessels. The targeted delivery of IGF-1 treatment promoted angiogenesis in the MI area, and the combination treatment of targeted IGF-1 and MSCs resulted in a further increase in angiogenesis in the MI area as indicated by the highest density of anatomical blood vessels in MI area.

利用组织切片后立即拍摄的荧光图像，通过测量绿色荧光的面积和强度，从其荧光特征来确定MI区域表达EGFP的MSCs的总数和密度。图6显示了(A) MSCs治疗组和(B) IGF-1 + MSCs治疗组心肌梗死后4周MSCs在心肌梗死区域的GFP荧光图像。如图6所示，IGF-1 + MSCs处理MI组与仅MSCs组相比，移植的MSCs总数和密度显著增加。

移植后3周免疫组化检测联合治疗后MSCs的分化情况。如图7所示，EGFP阳性细胞均表现出(A)抗心肌肌钙蛋白T和(B)抗α -肌动素免疫反应性，这表明在MSC移植3周后，移植的MSCs在心肌区分化为心肌的数量。(C)抗vimentin和(D)抗α -平滑肌肌动蛋白染色阳性，表明移植后3周大量移植的MSCs分化成血管。

尽管干细胞治疗心肌梗死在过去十年中取得了进展，但由于缺血心肌产生的不利微环境[39]，如血管生成不足、炎症和活性氧(ROS)的存在，有效的细胞递送仍然是成功修复心肌的主要障碍。这些不利因素会损害干细胞的存活、植入，并降低基于细胞的心肌修复的成功率。事实上，移植的MSCs的存活率和着床率很低，不到11%。这也取决于输注途径。心肌内注射MSCs的存活率为~11%，静脉输注MSCs的存活率为~3%，冠状动脉内输注MSCs的存活率为~3-6%[40-43]。因此，调控心肌微环境增加干细胞的植入、存活和归巢应该是干细胞治疗领域的主要目标。提高移植细胞存活率的策略有几种，如用生长因子预处理干细胞以提高植入效果[44]，用缺氧预处理干细胞以激活存活途径[45]，通过基因修饰干细胞过度表达抗死亡信号[24]，利用原位心脏组织工程[46,47]等。虽然这些策略在一定程度上被证明是成功的，但它们都未能改善恶劣的微环境，并可能产生不良的副作用。在本研究中，我们首次证明，在大鼠模型中，使用靶向IGF-1递送和MSC移植到心肌梗死区域的联合治疗，通过心肌梗死后4周心脏分数缩短的变化来测量，与仅使用IGF-1治疗或仅使用MSC治疗相比，心功能的改善最为显著。我们的数据显示，靶向递送IGF-1到心肌梗死区域大大提高了心肌梗死后4周的MSC存活率，并表明，通过靶向递送IGF-1治疗预先调节的局部微环境与心肌梗死后干细胞在心肌梗死区域的植入和更强健的血管形成相关。然而，尽管心功能有显著改善， we observed that very few stem cells underwent cardiac myocyte differentiation which may have limited the overall treatment efficacy.

虽然IGF-1治疗与间充质干细胞移植的联合治疗之前尚未进行过，但一些研究表明，IGF-1是一种潜在的治疗剂，可以改善心肌梗死等恶劣微环境中间充质干细胞的存活和植入[24-26]。这些研究表明，激活PI3k/AKT通路可使间充质干细胞更好地归巢到缺血微环境中，从而促进急性心肌梗死后心功能的恢复。为了尽量减少IGF-1全身给药的副作用，同时延长IGF-1在心肌梗死区域的停留时间，我们采用了通过生物相容性药物载体靶向给药的方法。本小组开发了长循环免疫脂质体[34,35,48 -51]，用于将另一种肽剂VEGF输送到心肌组织，并将抗血管药物输送到辐照肿瘤。

在本研究中，我们将免疫脂质体靶向递送IGF-1和心肌组织内MSCs植入相结合来治疗心肌梗死。我们选择心肌内注射MSCs，因为与其他途径(静脉注射~3%，冠状动脉内~3% - 6%)相比，这种途径提供了最高的细胞存活率和植入率(~11%)[52]。我们之前的研究表明，干细胞治疗的最佳窗口期可能是心肌梗死后两周内[53]。在这里，我们利用间充质干细胞移植后的炎症反应，使用抗pselectin包被的免疫脂质体选择性地将IGF-1传递到梗死部位。

各种体外和体内研究表明，干细胞治疗通过MSC的旁分泌作用部分恢复心脏功能[54,55]。因此，增加移植骨髓间充质干细胞的存活和植入，将直接增强骨髓间充质干细胞改善心肌功能的旁分泌作用。我们的研究结果(图5)表明，将IGF-1靶向传递到心肌梗死心脏，显著提高了心肌梗死后移植的间充质干细胞在宿主心脏组织中的存活和植入。为了观察移植的间充质干细胞的旁分泌作用，我们通过测量解剖血管数量的变化，间接评估了间充质干细胞旁分泌作用所表达的最重要的生长因子之一血管生成生长因子VEGF。我们的结果(图4)显示，与单独的MSC治疗相比，IGF-1 + MSC联合治疗显著增加了解剖血管的数量。为了进一步研究骨髓间充质干细胞移植后的命运，我们还观察了骨髓间充质干细胞移植后在心肌梗死区域的分化情况。我们的结果(图6)表明，部分MSCs分化为血管细胞和心肌细胞。综上所述，IGF-1+MSC治疗后心功能的改善可能与MSCs的旁分泌作用和MSCs向血管和心肌细胞的分化有关，这与文献一致[56,57]。

综上所述，本研究表明，骨髓间充质干细胞移植后立即靶向向骨髓间充质干细胞区递送IGF-1，可改善骨髓间充质干细胞因心肌区恶劣微环境而导致的低存活率和低植入性。此外，存活的MSCs促进了心肌梗死区域的血管生成，这进一步增强了移植MSCs的存活和植入。与仅使用IGF- 1或仅使用MSC相比，移植MSCs可显著提高心脏功能的恢复。这种恢复部分是由于骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞和血管细胞。总体而言，我们的研究结果表明，我们的靶向给药系统通过MSCs向血管细胞和心肌细胞的分化以及存活和移植的MSCs的旁分泌作用，显著改善了心功能。为了进一步改善心脏功能，其他治疗药物，如血管生成药物，进一步改善局部微环境和/或帮助心肌细胞分化的生长因子，可以纳入我们的靶向递送策略。

这项研究得到了美国心脏协会的支持。