通过使用培养依赖性和培养的方法 - 聚合酶链反应和变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）收集并研究了泰国南部南部南部传统方法培养的15种猪的细菌多样性。通过培养依赖性方法在猪粪便中观察到包括短杆菌，肉毒杆菌，肠球菌，乳酸杆菌，乳杆菌，乳酸乳杆菌和卵黄剂杆菌，包括六属。虽然通过分析直接从猪粪便中提取的DNA，观察到包括双歧杆菌，弯曲杆菌，鸡胸肉，肠球菌，乳杆菌，卟啉杆菌，Phivotella和葡萄球菌的含量。还筛选了从猪粪中分离的219个细菌的中和的细胞自由泳膜（NCFS）用于产生杀菌素的乳酸菌。在219个分离物中，在通过琼脂孔扩散测定试验时，任何分离物都没有针对指示剂菌株的抑制区。这表明从猪的粪便中分离的细菌中发现了产生的产生生成的菌株。

细菌多样性;PCR-DGGE;猪粪便;细菌霉素;乳酸菌。

通过使用培养依赖性和培养的方法 - 聚合酶链反应和变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）收集并研究了泰国南部南部南部传统方法培养的15种猪的细菌多样性。通过培养依赖性方法在猪粪便中观察到包括短杆菌，肉毒杆菌，肠球菌，乳酸杆菌，乳杆菌，乳酸乳杆菌和卵黄剂杆菌，包括六属。虽然通过分析直接从猪粪便中提取的DNA，观察到包括双歧杆菌，弯曲杆菌，鸡胸肉，肠球菌，乳杆菌，卟啉杆菌，Phivotella和葡萄球菌的含量。还筛选了从猪粪中分离的219个细菌的中和的细胞自由泳膜（NCFS）用于产生杀菌素的乳酸菌。在219个分离物中，在通过琼脂孔扩散测定试验时，任何分离物都没有针对指示剂菌株的抑制区。这表明从猪的粪便中分离的细菌中发现了产生的产生生成的菌株。

细菌多样性;PCR-DGGE;猪粪便;细菌霉素;乳酸菌。

在过去10年期间，来自几个来源的细菌多样性已经研究了土壤[1]，菲律宾发酵食品[2]，传统的自发性发酵λ啤酒[3]，人类肠道微生物植物[4]，断奶期间猪胃肠生态系统过渡[5]食物动物物种的胃肠道和胃肠道等。多种来源的细菌多样性研究使用培养方法，这些方法具有诸如耗时的差异，有限的鉴别能力和准确性和揭示。一些细菌多样性被低估了，因为大多数研究基于培养生物的方法，这可以仅表征生活在这些来源中的所有细菌的一小部分，因为这是大部分细菌不培养[7]。最近，基于从几种来源提取的总群落DNA的几种分子技术被广泛应用于评估微生物多样性[8-10]。聚合酶链反应变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）是用于监测细菌多样性和群落结构的分子技术，由于基于培养方法的可靠，可再现，较高，检测和识别势率，而不是更高的检测和识别潜力[11-13]。

通过使用培养依赖性技术和几种分子工具和几种分子工具进行了猪中肠道微生物的研究表明其优点是测量肠道微生物群落的不同方面[14]。通常，依赖于培养的技术可以对细菌的次要部分进行样品，其可能无法通过分子方法检测。与克隆方法相比，DGGE具有较少耗时和昂贵的优点，并且对来自不同样本的细菌群落结构的直接比较特别有巨大潜力[15]。由于PCR偏差未检测到较少数量的单个细菌分类，因此肠道细菌多样性可能被低估了，因为由于PCR偏差，不会检测到较小数量的单个细菌征集。通过使用PCRDGGE技术研究猪粪便中的微生物生物多样性可以有助于分离和鉴定用于人和动物的各种应用的新的或潜在的微生物，这些乳酸细菌（实验室）[16,17]。

实验室是革兰氏阳性的，非孢子形成Cocci，Coccobacilli或棒。它们通常具有厌氧呼吸和缺乏过症酶[16,18]。基于糖发酵模式，存在两种广泛的代谢类别，存在：同源性和异质化。在发酵过程中，这些细菌不会产生乳酸，但也已知它们的产生和排出具有抗微生物活性的化合物，这种杀菌剂[16,19]。

实验室的细菌病是核糖体合成，释放生物活性肽或肽复合物的抗微生物物质，具有杀菌或抑菌作用。它们是分泌的次级代谢产物，以抑制相似和/或竞争性细菌菌株的生长。大部分细菌素都很小，基本（中性或略微酸性pH的净正电荷）和自然界中的两亲子。它们在频谱和活动模式中各不相同。它们还显示出不同的分子结构，分子量，热稳定性，活性和遗传决定簇的pH值[17,20]。目前，由于它们通常被认为是安全（GRAS）状态，细菌霉素生产实验室是广泛的研究，因为它们可以防止许多致病和腐败细菌的生长，例如金黄色葡萄球菌，李斯特菌李斯特菌，大肠杆菌Coli，假单胞菌SPP。，Bacillus SPP。和Clostridium spp。[17]。

因此，本研究的目的是通过使用文化依赖性方法和培养的PCR-DGGE和培养的培养物的培养物，从泰国南部南部培养的猪培养的猪培养的猪粪便筛选的培养物的实验室来研究细菌多样性。用作进一步研究中的潜在信息。

从位于泰国南部的养猪场收集了十五个粪便样品，其中通过传统方法培养，既不用于饲料也不使用饲料或治疗目的。将样品（25g）无菌转移至225ml的生理盐水溶液（0.85％NaCl，0.1％蛋白胨），得到1:10稀释，然后摇动1分钟。在无菌生理盐水溶液中制备了适当的小数稀释液（10-4至10-6），并在De Man，Rogosa和Sharpe（Mrs，Hi-Media，India）琼脂板上涂抹。然后将板在37℃下在厌氧条件下孵育24小时。在琼脂夫人上随机选择形态学上独特的菌落，单独挑选和条纹。重复该过程以纯化分离物。通过将3％的过氧化氢溶液放置在细胞上来测试分离株。立即形成气泡表明细胞中的过氧化氢酶。分离物在光学显微镜下染色并观察到[21]。在含有30％甘油（Scharlab，S.L.，USA）的MRS肉汤中，将细菌分离物保持在-20℃。 For all experiments, the strain was sub cultured twice at 37°C in MRS broth for 24 h.

所有指示菌株均从Oniris(法国南特国立大西洋大学Vétérinaire, Agroalimentaire et de l’alimentation，南特，法国)和INRA(法国南特国家农业研究所)获得。生长培养基、生长条件及指示菌株来源见表1。在含有30%甘油的低温保护培养基中，菌株在−80°C下保持为冷冻种群。在所有的实验中，菌株在每个菌株特定的培养基和生长条件下传代两次。

无细胞上清液（CFS）和中和CFS（NCF）的制备：将分离物（第4.1节中描述）在37℃的MRS肉汤中生长24小时。通过离心（9500g 10分钟在4ºC）获得CFS。通过通过6N NaOH将pH调节至7.0来制备NCF，以排除有机酸的抗微生物作用。通过加入1mg / ml过氧化氢酶消除来自过氧化氢（H 2 O 2）的抑制活性。将样品在100ºC下加热10分钟以抑制酶活性[16,21]。

用琼脂孔扩散法测定产细菌素菌株:将BHI或MRS软琼脂（1％琼脂，W / V）用106个菌落形成单位（CFU），每毫升指示剂细菌菌株表1，混合并倒入无菌培养皿中。设置后，使用无菌软木螟制备直径5毫米的琼脂井。将由第4.3.1条制备的等分试样（50μl）的NCF置于孔中。如表1所示，将平板在每个指示剂菌株的最佳温度下孵育过夜，然后观察抑制区并记录[17,22]。

通过根据制造商建议使用Peqgold细菌DNA试剂盒（随机选择的4.1节，从4.1节选自选定）的过夜培养物中提取总DNA（从4.1节中选择），并储存在-20°C直到使用。用PCR用作总DNA作为扩增16S rDNA基因的模板。扩增片段的测序由GmbH（Ebersberg，德国）的Eurofins基因组学进行。将获得的序列与GenBank数据库中可用的序列进行比较，使用国家生物技术信息中心的基本局部对准搜索工具（Blast）在国家生物技术信息网站http：//www.ncbi.nlm。nih.gov。

DNA提取：使用Genome DNA Extraction Kit (Tiangen Inc.， Beijing)按照厂家说明从1 g猪粪中提取总DNA，并在−20℃下保存至使用。

PCR扩增6S rDNA的V3区域：PCR在含有50μL的祖母绿DAMPGT PCR主混合物（Takara Bio Inc.，日本）25μL，每个引物2μL（10μM），DNA模板2μL和RNase-免水19μL的总反应体积中进行。使用引物组，357F-GC（5'-GC-CLAMP-CCTACACGGGAGGCAG-3'）和518R（5'-ATTACCGCGCGCTGCGGCG-3'），跨越16S rDNA的V3区域。甲GC钳（CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG）加入到用于DGGE分析[15]的引物357F。使用初始变性步骤在94℃下使用5分钟的初始变性步骤产生PCR产物。然后在94℃下进行30个变性30秒，在55℃下退火30秒并在72℃下伸长45秒。然后将最终链伸长率在72℃下进行7分钟。

DGGE分析：PCR产物按照厂家说明使用DGGE系统(Bio-Rad Laboratories Ltd, England)分离。样品(各25 μl)加载到1毫米厚的8% (w/v)聚丙烯酰胺凝胶中，凝胶中含有丙烯酰胺:双丙烯酰胺37.5:1，变性梯度为30 - 65%(100%变性对应7 M尿素和40% (w/v)甲酰胺)。电泳采用35 V恒压10 min, 85 V恒压16 h, 60℃。用SYBR金溶液(Thermo Fisher Scientific Inc.， Australia)对凝胶进行15分钟染色，然后在无菌水中冲洗三次，并在紫外线照射下观察。使用凝胶文件系统(UVitec Cambridge, England)拍摄凝胶图像。

DGGE片段的切除和排序：用无菌手术刀切除DGGE条带，用20 μL无菌milliq水洗脱各条带的DNA, 4℃过夜。在上述条件下，从每个DGGE条带中提取5微升洗脱的DNA进行再扩增。引物357F不包含gc钳被使用。测序分析用PCR纯化试剂盒(QIAGEN Inc.， USA)对PCR产物进行纯化，并作为测序反应的模板。这些样本用自动DNA测序仪进行分析。利用美国国家生物技术信息中心的BLAST网站，将获得的序列与GenBank数据库中的序列进行比较。

为筛选产细菌素的乳酸菌，采用琼脂孔扩散法对传统方法培养的猪粪便中分离到的219株革兰氏阳性菌进行检测，检测指标菌株如表1所示。从这219种细菌中获得的中和细胞游离上清(NCFS)没有显示出抑制区。这说明在这些分离株中，没有任何分离株产生细菌素。

表2中显示了27种所选细菌的形态和鉴定。当获得的序列与Genbank数据库中可用的序列进行比较时，它可以将这些27分离物分为6个属，包括短杆菌，肉毒杆菌，肠球菌，乳酸杆菌，乳酸乳杆菌和Leuconostoc11种，包括短杆菌途径，短杆菌酪虫，血管基曲杆菌，颅杆菌，血管基因菌，肠球菌粪便，肠球菌粪便，乳酸乳杆菌，乳酸乳酸乳酸乳杆菌，嗜睡症乳酸，leuconostoc carnosum和leuconostoc gelidum。该结果表明，在泰国南部的传统方法培养的猪粪便中含有各种各样的细菌。然而，DGGE分析没有检测到大部分这些菌株作为低于下面的DGGE轮廓。这可能是因为使用MRS琼脂作为一些来自猪粪的基础培养基分离细菌。基本上，MRS是乳酸杆菌的选择性培养基，但是可能发生了Leuconostocs和Pediococci的一些生长[23]。

通过使用引物357F-GC和518R扩增16S rdNA基因的猪场中，从位于泰国南部的猪场中收集的15种猪粪样品的细菌多样性的直接分析的结果。通过传统方法培养的猪的粪便中具有很高的细菌。在DGGE的基础上，在每个样品中发现了细菌的社区结构中的不同条带。当通过PCR-DGGE分析时，来自猪粪便的提取的DNA的样品显示有条带图案的变化。不同细菌种类的DGGE条在聚丙烯酰胺凝胶中的不同位置分离，因为不同的细菌物质在碱基对组合物中具有差异[24]。在所有模式中，每个样品检测到5-15个各种强度，在所有样品中有17个条带，因为它们在16S rDNA的可变区内具有碱基对组合物的差异。

该DGGE型谱表明，在通过传统方法培养的猪的粪便中由至少17种细菌组成（图1）。当将来自DGGE条带的16S rDNA部分序列与Genbank中的数据库进行比较时，第1号和第2条分别是肠球菌粪便和肠球菌粪便的特征。发现3号和4号分别对应于乳酸杆菌和乳杆菌序列的序列。而另一个乐队没有实验室的特征。第5号和第6段分别显示出与梭菌葡萄糖和梭菌薄膜的100％相似之处。第7号乐队显示与PREVOTALLA albensis 100％相似之处。第8号和第9座是抗振动杆菌和弯曲杆菌胎儿的特征。胎儿分别。第10,111号和12段分别是卟啉硅氧烷，卟啉尼孢菌和卟啉核糖菌的特征。第13号和14带分别显示与双歧杆菌和双歧杆菌动物的100％相似之处。 The last 3 bands (No. 15-17) were characteristic of Staphylococcus vitulinus, Staphylococcus delphini and Staphylococcus simulans, respectively Table 3.

通过传统方法培养的猪场收集的PCR-DGGE直接分析的结果表明，LACT等实验室。淀粉素，Lact。Reuteri，ENT。粪便和耳鼻喉科。粪便是主要的微生物，因为大多数猪粪便样品被发现PCR-DGGE型材中的共用带。但是，一些非实验室如Cl。Leptum，Por。Asaccharolytica，营地。胎儿子。胎儿和营地。 avium were also the dominant microorganism in feces of pig. Culture-dependent method did not detect most of these strains as the identification of the selected bacteria result above. This was probably because the cell numbers of these strains were higher than those strains for the detection of PCR-DGGE. In addition, biases at the level of DNA extraction and PCR specificity and efficiency could also have been reasons [25].

我们获得的结果类似于Peu等人的报告。[26]谁在厌氧储存和管理期间研究了猪浆微生物群落的动态。他们报道了几种细菌群体，被确定为与未培养的梭菌和卟啉组和卟啉杆菌和乳杆菌和患有猪粪中的链球菌和链球菌培养物种密切相关的种群，从饲养延长到蔓延的时间中存在和显着。在类似的研究中，Snell-Castro等人。[27]特征在于猪粪储存坑中的微生物多样性。他们报道，大学典型和克隆丰度最常表示的细菌群是易剖腹产，梭菌，芽孢杆菌 - 乳杆菌 - 链球菌细胞细胞，支原体和亲属和柔韧性 - 细胞杆菌菌。全球微生物群落结构和文型多样性显示出与猪胃肠道生态系统的密切关系，而来自Acholeplasma-Anaeroplasma和梭菌紫外线基团的植物似乎在粪肥中似乎更好地代表。古代多样性由三个种植型聚集在一组未脱有的未知活性的微生物，并且只与热正相体和亲属差异。

本研究是首次报道泰国南部采用传统方法培养的猪粪便中的细菌群落，采用培养依赖和培养独立(PCR-DGGE)技术。结果表明，用传统方法培养的猪粪便中含有丰富的细菌谱。两种方法都能检测到猪粪便中不同的细菌菌株。上述结果表明，结合和比较两种培养依赖法和非培养依赖法的结果，可以更好地描述猪粪中微生物群落。然而，作为我们的目标之一，我们无法从这些粪便样本中分离出任何能产生细菌素的乳酸菌。然而，我们的结果为进一步研究猪粪便的细菌群落提供了重要的信息。

这项工作是泰国国家研究委员会（NRCT）的财务支持（项目代码号。r2559b007）。它也是纳雷斯轩大学，北百国，博鳌自然资源和生命科学大学，维也纳，奥地利和奥地利联邦科学，研究和经济部（BMWFW）博士的金融支持的金融支持于欧洲议员的框架内Mach-Stipendien，2017年ASEA-Untinet。

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