摘要目的:骨髓细胞会受到来自内部环境的各种化学和机械刺激。在体内，流体剪切应力(fluid shear stress, FSS)是影响骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchystem cells, BMCs)活性的主要机械刺激之一。由于不同情况下FSS对骨髓细胞活性的影响不同，本研究的目的是确定稳定和不稳定变化的FSS如何影响成骨和破骨细胞形成中的骨髓细胞活性。

方法：取小鼠股骨的骨髓基质细胞标本，分为稳定变化FSS刺激组、不稳定变化FSS刺激组和无FSS刺激组。RT-PCR检测所有样品在3点处的OPG、RANKL、ALP、OCN、RUNX2、RANK^{理查德·道金斯}的一天。6点全部标本采用茜素红染色和TRAP染色进行检测^{理查德·道金斯}的一天。

结果：S组样品显示RANKL mRNA中最低水平，并且在OPG mRNA中显示出最高水平。S组中的Rankl / OPG mRNA是三组中最小的。与C组样本相比，S组中的Runx2 mRNA显着增加。C组中的等级mRNA是三次的三倍。S集团具有最大的矿化结节区域，最大的面积≥100μm，≥500μm²或≥1000μm.²．三组中，S组TRAP阳性染色面积最小。

结论：稳定的变化FSS显着增加了与OPG-Rankl-Rankl途径有关的成骨发生。与不稳定的FSS相比，稳定的变化FSS对骨开发具有更合适的刺激。

流体剪切力，骨髓细胞，成骨细胞，成骨，OPG-RANKL-RANK。

摘要目的:骨髓细胞会受到来自内部环境的各种化学和机械刺激。在体内，流体剪切应力(fluid shear stress, FSS)是影响骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchystem cells, BMCs)活性的主要机械刺激之一。由于不同情况下FSS对骨髓细胞活性的影响不同，本研究的目的是确定稳定和不稳定变化的FSS如何影响成骨和破骨细胞形成中的骨髓细胞活性。

方法：取小鼠股骨的骨髓基质细胞标本，分为稳定变化FSS刺激组、不稳定变化FSS刺激组和无FSS刺激组。RT-PCR检测所有样品在3点处的OPG、RANKL、ALP、OCN、RUNX2、RANK^{理查德·道金斯}的一天。6点全部标本采用茜素红染色和TRAP染色进行检测^{理查德·道金斯}的一天。

结果：S组样品显示RANKL mRNA中最低水平，并且在OPG mRNA中显示出最高水平。S组中的Rankl / OPG mRNA是三组中最小的。与C组样本相比，S组中的Runx2 mRNA显着增加。C组中的等级mRNA是三次的三倍。S集团具有最大的矿化结节区域，最大的面积≥100μm，≥500μm²或≥1000μm.²．三组中，S组TRAP阳性染色面积最小。

结论：稳定的变化FSS显着增加了与OPG-Rankl-Rankl途径有关的成骨发生。与不稳定的FSS相比，稳定的变化FSS对骨开发具有更合适的刺激。

流体剪切力，骨髓细胞，成骨细胞，成骨，OPG-RANKL-RANK。

碱性磷酸酶= ALP，骨髓衍生的间充质干细胞= BMCS，Connexin 43 = CX43，补体组分3a = C3a，C-Jun N-末端激酶= JNK，细胞外调节蛋白激酶= ERK，细胞外信号调节激酶=ERK5，流体剪切应力= FSS，第一凋亡信号配体= FASL，糖原合成酶激酶3β=GSK3β，溶血磷脂酸= LPA，间充质干细胞= MSCs，巨噬细胞菌落刺激因子= M-CSF，单核细胞化学蛋白-1 = MCP-1，核因子κB的受体激活剂κB=核因子κB配体的受体激活剂= RANKL，RUNT相关转录因子2 = RUNX2，P2Y受体₂= P2Y.₂R，含重复的G蛋白偶联受体4 = LGR，Semaphorins = Sema，酒石酸尿酸酸α=捕获，瞬态受体电位阳离子通道亚家族M成员7 = TRPM7，Trpm7，Trpm7，Trpm7，Trpm7，Trpm7，Tudornecrosyfactorrector Essumber Fortors = TRAF，骨盆= OPG，Osteocalcin =OCN，Osteopontin = opn。

由于它们的多分化电位[1]，骨髓衍生的间充质干细胞（BMC）被吸引了相当大的关注。在骨组织中，骨细胞和成骨细胞分别是骨分解细胞和骨形成细胞。它们在骨改造过程中彼此合作。骨核苷酸分化与单核细胞/巨噬细胞谱系的单核细胞分化。骨细胞衍生自中间充质干细胞（MSC）。此外，它们的分化和成熟受到骨髓环境的影响。体内，骨细胞围绕不同的刺激，包括化学和机械方式[2]。主要机械刺激是流体剪切应力（FSS）[3]。

研究发现了FSS和骨质发生或骨髓细胞间之间的联系。P2Y2R [4]，TRPM7 [5]，CX43 [6]和Megakaryocytes [7]作为机械敏感因子接受剪切应激刺激，然后调节骨肉发生。通过ERK5途径从剪切应力促进成骨细胞和破骨细胞分化[8-10]。将MLO-Y4骨细胞样细胞暴露于不同时期的流体流动剪切应力。在FSS刺激后的第一个小时内，OPG mRNA水平显着上调[11]。来自6个月大的Sprague Dawtey大鼠椎骨的BMC被1,25（OH）D3诱导，并在30min的FSS介入。增强捕集活动，骨吸收区域增加[12]。成林刘等人。发现流体流动诱导钙屈服于骨质体[13]的反应增加。

骨是多孔组织。机械负荷导致骨组织中的变形，应变梯度和局部压力。它可以驱动间质液流动，然后导致骨髓细胞上的FSS [14]。在体内，根据不同的物理活动[15]，FSS在8-30达克/ cm2之间变化。骨被压缩2000或3000微株[16]。verbruggen sw等人。预测平均间质液速度为60.5μm/ s，平均最大剪切应力为11pa周围的骨细胞in-vivo [3]。

用于模拟骨组织中真实内部环境的合适装置对于研究FSS和骨开发之间的特定机制至关重要。在我们的Studie中，我们使用了基于小州周等人的“见面”系统等振荡。模式[17] l模仿体内BMC上的FSS。与其他FSS系统相比，这个更容易，更便宜，更方便。我们的设备中有两个不同的FSS案例。FSS可分为稳定的变化FSS和不稳定的变化FSS。

在本实验中，我们提供两个不同的FSS病例给骨髓基质细胞，测量成骨或破骨形成的标志物因素来分析FSS对骨髓基质细胞的影响。

4周龄雄性昆明小鼠断颈处死，取股骨。取软组织标本，用PBS冲洗。切断骨两端后，用89% DMEM+10%胎牛血清+1%青霉素-链霉素的完全培养基(89% DMEM+10%胎牛血清+1%青霉素-链霉素)注入骨髓腔，获得骨髓细胞。2×10⁶细胞/孔与2.5毫升或3.5毫升完全培养基中的标准的六孔板中培养。完全培养基，每3天更换一次。

培养板是商业六孔板。每个孔的底部区域为9.6厘米²．根据不同的培养基设置3组。C组(对照组)每孔培养3.5ml，保持水平。S组和V组各孔中分别有3.5ml和2.5ml培养基。当培养板位于水平台式浓缩机上时，培养基深度分别约为2.604 mm和3.6mm。

FSS协议由我们实验室的设备产生。电动机装置是妊娠-M5表浓缩器，摇晃0.5Hz，每天2次摇晃30分钟。该装置的托盘为240mm×230mm，最大倾角为12°。培养板位于托盘的两侧并平行于托盘辊。当表浓缩器倾斜时，每个孔中的培养基从一侧到另一侧流动。

FSS处理BMCs 3 d后，PBS冲洗2次。用Trizol (Invitrogen，美国)、Chloroform、异丙醇和乙醇依次提取总RNA，然后定量(Kaiao，中国)，用RevertAid进行逆转录^TM第一链cDNA合成试剂盒（Fermentas公司，LTU）。将cDNA用SYBR Green荧光核酸染料（Invitrogen，USA）的通过实时PCR机（ABI，USA）的掺入扩增。2^{[△△循环阈值（CT）]}值用于计算细胞因子表达的折叠变化。△CT= CT的细胞因子 - CTα-肌动蛋白;△△CT=Ⅳ治疗组CT - ⅣCT对照组。在每个基因的RT-PCR中使用的PRI MERS显示在表1中。

表格1：用于RT-PCR的引物列表。

将BMC培养6天后，将它们用PBS洗涤两次。使用乙醇来固定细胞，然后使用0.1％茜素红S-TRIS-HCl（pH = 8.3）将细胞在37℃下染色30分钟。在显微镜（奥林巴斯，日本）中矿化结节是红色的。该区域大于100μm的矿化结节数²，500μm²和1000μm²分别计算成矿化结节和其总面积（图像Pro加6.0）。

治疗6 d后，用PBS冲洗2次，持续3分钟。2.5%戊二醛固定细胞，37℃50分钟TRAP染色。镜下见破骨细胞为桔红色细胞。每个样品在显微镜下取10个视场。计算阳性细胞面积(Image-Pro Plus 6.0)。

使用Pro-E 5.0软件评估培养培养基深度的变化。单向ANOVA用于评估GraphPad Prism 5.0软件组中的差异。数据表示为平均值±标准偏差。统计显着性通过P <0.05测定。

摇盘中的FSS图案复杂，空间是异质的。为了分析三组的不同条件，我们在井中设置了培养基的中间垂直横截面以量化参数。笛卡尔坐标系是用X轴沿盘底，z轴沿盘侧壁的X轴创建，原点点（O）位于旋转中心。整个盘沿围绕垂直平面旋转（o）。（图1）。

C组每孔灌满3.5ml培养基和h₀是3.6毫米。培养板用无刺激的地平面解决。

在S组中，每个井都装满了3.5ml培养基和H.₀是3.6毫米。当摇床从地平线平面移动到12°时，整个盘底部总是通过介质覆盖。其结果是，没有区域会在干扰过程中暴露出来。该FSS不会被削减，而变化将不断并定期。与V组相比，FSS变化较稳定。

所以，在S组的FSS被定义为稳定的变化。

V组每孔灌满2.5ml培养基，h0为2.604mm。当工作台集中器从水平平面移动到12°时，面积约为95.28mm²在周边区域暴露于空气（图2）。由于振荡是周期性和对称性。有暴露的孔底的两个10％周边区域。该FSS在这一刻暴露了巨大的变化。因此，V族在FSS被定义为不稳定的变化。

如上面提到的，FSS是在应力被改变所有的时间非均匀的图案。这是太困难估计FSS在每一个点，每一刻。其结果是，在培养皿底部时，盘是在振荡过程的水平的中心的剪切应力被定义为特性FSS（|τ（〜）|）。因为FSS变化将在该值附近，它可以被似乎，S组和V组来估计FSS的标准。根据公式（δ= h₀/ l）^[17]， S组的特征FSS(|τ(~)|)为0.62dyn/cm²和V组为1.18dyn /厘米²．两组在不同时间点(x/L=0.25,0.5,0.75) FSS的变化见图2。两组FSS在不同时间点的峰值见图3和图4。

PCR结果显示，成骨S组明显高于其他组突出。这是成骨相关的一些基因的第3天进行检测。S组中RANKL表达是在一个较低的水平与C组比较。S组中的OPG mRNA的表达比C组显著更大。仅在S组与在RANKL / OPG mRNA表达的C组一个显著差异。RANKL和OPG mRNA表达的V族中的变化是不显著。RANK与破骨细胞形成有关。S组中的mRNA的表达要低得多相对于C组，但其在V组中的表达无与其它基团不同显著。RUNX2，OCN，ALP的mRNA表达在图中2所示。只有RUNX2有S组和C组之间差异显著。 (Figure 5 and 6).

矿化结节代表成骨细胞的成骨水平。我们量化了面积≥100μm的数字的矿化结节²，≥500μm²≥1000µm²．以及分别为总区域量化。在区域≥1000μm²和≥500μm²， S组的数量远多于其他组。≥100µm²， S组明显多于C组，与V组相比无明显变化。同样，在三组中，S组矿化结节总面积最大。(图7和8)

破骨细胞分化是由标记抗酒石酸酸性phosphatese（TRAP）进行评价。TRAP是BMC的主吸收功能的蛋白质。TRAP +细胞的区域表示破骨细胞的分化水平。在TRAP +区三组间比较，我们发现区域是在S组中最小的。这表明，稳定的变化，FSS可以抑制osteoclastsgenesis。（图9和10）

骨可以定义为由破骨细胞和成骨细胞动态平衡组成的稳态组织。在连续的循环中，破骨细胞通过分泌质子和胶原分解酶[18]来吸收和溶解基质中的无机和有机成分。成骨细胞负责骨重建和形成[19,20]。此外，破骨细胞在不同分化阶段与成骨细胞相互作用[21]。

许多研究一直集中于促进成骨细胞活性或抑制骨吸收以避免骨质损失，通过激素或化学化合物破坏重塑循环的特异性部分[22]。然而，这些研究忽略了骨组织的内在能力，以适应环境的外部刺激。实际上，机械负载可以通过促进骨形成和抑制体内骨吸收来帮助提高骨质量[23]。生理上，剪切应力可以作为主要机械刺激从血流量和间质液到细胞[24]。许多研究表明，适应性的FSS可以改善成骨，如0.15dyn / cm²[25]，12dsn / cm 2 [26-28]，16dyn / cm 2 [29]和12×10-5n [30]。Zhao，LG证明，流体剪切应力通过MEK5 / ERK5途径促进ALP活性和OPN和OCN的表达[31]。除此之外，初级鼠成骨细胞在5Hz和10 dyn / cm 2中对FSS进行FSS，在FSS后2小时诱导RANK1，并保持升高至少8小时[32]。虽然有各种研究已经发现FSS和骨细胞之间的关系，但大多数方法都向骨缩醛或BMC提供了可持续的FSS，以研究不同FSS幅度的效果。他们创建了一种模型，以向骨骼单元提供间歇性FSS，以探索FSS和时间之间的关系。但是，所有上述FSS都只是保持一定的值，这不能将FSS模仿在体内BMCS周围的真实条件下。实际上，根据不同的体育活动，FSS在体内并不恒定。在人类股骨的体内测试中，在生理载荷期间压力达到1至2kPa，头部高于颈部的压力较高，并用负荷率加上[33]。此外，随着时间的推移，效果降低。Cui l等。 al confirmed a constantly FSS can enhance OPG mRNA expression at 12 hours, but no significant difference at 24 hours [11], indicate that cells can gradually adapt to mechanical intervention when the stimulus is constant [34].

骨细胞虽然是骨组织中主要的机械感细胞，但骨髓中的细胞也具有机械感。Soves等人在体内对小鼠肢体进行机械加载，诱导骨髓细胞[7]之间的机械信号。Li和Mantila Roosa等人证实，机械负荷可促进骨髓基质细胞增殖和成骨基因表达[35,36]。此外，在骨髓环境中，成骨细胞和破骨细胞相互作用，保持骨组织的动态平衡。破骨细胞与成骨细胞的沟通至少有三种途径。首先，成骨细胞和破骨细胞可以直接接触，允许膜结合配体和受体相互作用。其次，它们形成缝隙连接，允许水溶性小分子在两种细胞之间通过。第三，传播发生于弥漫性旁分泌因子，如生长因子、细胞因子、趋化因子等小分子[37]。细胞-细胞通信发生在骨髓的基本多细胞单位(BMU)，这是一组通过骨重塑[38]过程实现结构改变和骨骼更新的细胞。在骨重塑的各个阶段都存在着沟通。 At initiation phase of remolding process, hematopoietic precursors are recruited to the BMU and then differentiate into osteoclasts [39]. In this phase, OPG-RANKL-RANK axis and LGR4- RANKL-RANK axis plays an important role in regulation of osteoclastgenesis. RANKL and RANK are indispensable factor in osteoclast differentiation. OPG and LGR4 will compete with RANK to bind with RANKL. It directly influences the differentiation of hematopoietic precursors to osteoclast [37,40,41]. OPG is produced by many types of cells like osteoblast and osteocyte. In bone marrow, it has been shown that B cells are the major source of OPG in mice [42]. Besides that, M-CSF is also the key factor in osteoclast differentiation. Osteoblast can secrete M-CSF and MCP1 to keep osteoclast precursors proliferation and surviv in bone marrow. In addtion, Sema3A/Nrp [43] and Lysophosphatidic acid (LPA) [44] are released by osteoblast can affect osteoclast differentiation in different pathway. Subsequently, transition from bone resorption to formation by osteoblast can also be mediated by osteoclast. It directly influences the differentiation and activation of osteoblasts in resorbed lacunae to refill it with new bone. Most of these molecules are released by resorbed bone matrix or osteoclast. Matsuoka founds that Complement Component 3a (C3a) was progressively increased during osteoclast differentiation. Its bioactive fragment 3a can stimulate the osteoblast differentiation. The C3a receptor was mainly expressed in calvarial osteoblasts [45]. Negishi-Koga et al. showed that osteoclasts can highly express Sema4D and it potently inhibits bone formation through the receptor plexin-β1 of osteoblasts [46]. Besides, some factors also serve as a bridge for the communication. Estrogen can affect osteoclast survival through the upregulation of FasL in osteoblasts, inducing the apoptosis of osteoclasts precursors [47]. Considering the interaction between osteoclast and osteoblast in bone marrow, we thought that choosing BMCs was appropriate for studying the specific effect of FSS in bone homeostasis.

由于工作台集中器托盘从水平面向最大角度倾斜，介质深度随时间变化，这将导致过程中连续变化。它给细胞一个可变的机械应力作为干预。考虑到金融监督院的变化方式不同，我们在金融监督院设置了两种不同的情况。第1例(S组)，井中有足够的培养基;在整个振荡过程中，介质可以覆盖整个碟底。另一种情况(V组)，井中没有足够的培养基。当培养板角度达到12°时，培养基会向一侧流动。另一边的一些外围区域会暴露在空气中。一旦暴露，金融监督院就发生了巨大的变化。周小周证明了如果振荡角度合适或者板内介质足够，FSS的变化将是有规律的[17]。 Considering 3ml is a common volume of medium for standard six-well culture plate. In order to ensuring sufficient nutrients for cells growth, we set 3.5ml medium as the S group and 2.5ml medium as the V group to satisfy our research demands.

在第3天干预之后，我们发现S组的骨质发生是最好的一组，并且三组中的骨质核酸酯是最差的。我们发现，S组中的Runx2，OPG和Rankl / OPG与我们的Studie中的C组有显着差异。等级和Rankl主要是骨细胞的因素，它们的组合可以促进骨壳的分化。在OPG-Rankl-Rankl途径中，OPG与Rankl结合，然后阻止Rankl [48,49]所以，OPG也称为骨酸溶解抑制因子。opg的增加可以直接引发骨髓性胰腺炎。Runx2是成骨细胞分化中的调节剂，它在骨形成中起作用。所有结果表明，FSS的稳定改变改善了BMC中的骨质发生，并且可以在FSS刺激期间在第3天检测到。与mRNA表达相关的成骨细胞的所有结果，只有ALP和OCN都没有显着差异。ALP是骨形成标记，OCN是骨代谢和能量代谢的因素，它们通常被发现在后期的成骨细胞分化和在骨质发生中的作用。在我们的研究中，FSS幅度相对较低，三天太短，无法检测ALP和OCN mRNA水平的变异。 On the 6^th日，我们使用矿化结节作为符号来检测成骨的程度。正如我们所预测的那样，S组的结果与C组显着。上述结果表明，稳定的变化FSS对成骨细胞形成具有积极影响。

除此之外，我们还探讨破骨细胞形成的通过检测RANK mRNA表达水平和TRAP +色斑的程度。RANK是ostelclastgensis的主要调节器和RANKL [39,50]的向下蒸汽。与RANK RANKL接触招募TNF受体相关因子（TRAFs）激活各种信号传导途径，促进破骨细胞形成。但他们的接触可以通过OPG占据结合部位受损。RANK表达手段破骨细胞形成被抑制的减少。在RANK mRNA表达水平，S组比C组。S组中TRAP +污点的总面积为三组中的最小的，它证明了稳定改变FSS还可以通过减少RANK mRNA表达抑制破骨细胞形成。此外，大部分的V族的这些检测结果的具有与对照组没有差异。但是，我们仍然注意到V群的小的变化。班ÿ证明了间歇流动的丛生相比，连续流为成骨细胞活性[51]更好的环境。 That indicated the effect from unstable changing FSS was more weakly to stable changing FSS. In conclusion, we thought that enough volume of medium can afford a stable changing FSS, and this was an appropriate stimuli for osteogenesis in BMCs.

该FSS器件完美地模仿体内微环境，并在复杂的骨髓细胞培养系统中对骨质发生具有效果。足够的培养基体积产生稳定的变化FSS，它有利于骨质发生。考虑到FSS对BMC的影响，将这些FSS施用于成骨细胞或骨质体是有意义的，并且可以有助于揭示从FSS到细胞的特定信号途径。