目的:AmpliSeq技术是下一代测序（NGS）的目标富集方法，能够快速、简便地检测物种中频繁突变的基因组“热点”区域。尽管NGS的成本有所下降，但图书馆准备成本在总成本中所占比例更大。如果AmpliSeq库可以以较低的成本制备，那么大规模精确肿瘤学就可以更容易地进行。此外，该技术不仅可以广泛应用于医学研究，还可以应用于生物学中的多态性检测。本研究旨在通过采用小型化技术降低AmpliSeq库制备成本。

方法：我们使用了大约10 ng的基因组DNA对384、768、1152、1920和3072个扩增子进行了超多重PCR。在总体积为1.6、2.0和2.4 μL的条件下进行多重PCR，使用纳米升液体处理程序进行文库制备。

结果：随着多重PCR总反应量的减少，构建文库的成功率降低。采用1.6、2.0和2.4 μL反应，超多重PCR的成功率分别为25%、95%和100%。我们可以稳定地创建正确大小的扩增子库，扩增子数大约为1500或更少。NGS的结果表明，PCR扩增的一致性和质量文库的读长几乎不受扩增物数量的影响。

结论：在这里，我们证明了稳定反应的最小体积为2.4 μL，获得的最大扩增子数约为1500个。与手工方案相比，该方案节省了86.8%的试剂使用量，减少了85%的处理时间。因此，微型化技术可以通过最小化试剂来降低AmpliSeq文库制备的成本。

扩大仪;脱氧核糖核酸;PCR;小型化技术;下一代测序（NGS）。

目的:AmpliSeq技术是下一代测序（NGS）的目标富集方法，能够快速、简便地检测物种中频繁突变的基因组“热点”区域。尽管NGS的成本有所下降，但图书馆准备成本在总成本中所占比例更大。如果AmpliSeq库可以以较低的成本制备，那么大规模精确肿瘤学就可以更容易地进行。此外，该技术不仅可以广泛应用于医学研究，还可以应用于生物学中的多态性检测。本研究旨在通过采用小型化技术降低AmpliSeq库制备成本。

方法：我们使用了大约10 ng的基因组DNA对384、768、1152、1920和3072个扩增子进行了超多重PCR。在总体积为1.6、2.0和2.4 μL的条件下进行多重PCR，使用纳米升液体处理程序进行文库制备。

结果：随着多重PCR总反应量的减少，构建文库的成功率降低。采用1.6、2.0和2.4 μL反应，超多重PCR的成功率分别为25%、95%和100%。我们可以稳定地创建正确大小的扩增子库，扩增子数大约为1500或更少。NGS的结果表明，PCR扩增的一致性和质量文库的读长几乎不受扩增物数量的影响。

结论：在这里，我们证明了稳定反应的最小体积为2.4 μL，获得的最大扩增子数约为1500个。与手工方案相比，该方案节省了86.8%的试剂使用量，减少了85%的处理时间。因此，微型化技术可以通过最小化试剂来降低AmpliSeq文库制备的成本。

扩大仪;脱氧核糖核酸;PCR;小型化技术;下一代测序（NGS）。

使用下一代测序（NGS）进行测序（GBS）的基因分型正在成为生物学和农学领域的一种越来越有用的技术[1-3]。近年来，虽然图书馆准备成本和时间仍然保持高度，但每碱基测序的成本急剧减少。

AmpliSeq技术（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）是一种常用于癌症研究的GBS方法[4]。尽管AmpliSeq库试剂盒非常昂贵（约64美元或9500日元/样本），但它可以实现高度多重PCR（约6000对引物）。AmpliSeq技术也开始用于其他领域，并在生物学和农学领域作为AgriSeq出售[5,6]。

在农学领域，特别是在作物育种地点，经常进行数千个大样本的基因分型。然而，GBS仍然是昂贵的，需要大量的时间和劳动来进行分析。它在实际作物育种中应用困难，主要用于科研或项目。降低建库成本是降低建库成本的快速途径。最简单的方法就是减小反应体积。在手工编制图书馆时，将数量减少一半以上到四分之一是不现实的。在手工制备的情况下，随着反应体积的减少，库的质量极有可能下降。因此，为了充分降低成本，有必要让机器人能够输送人类无法处理的少量液体。

到目前为止，只有少数关于GBS中小型化库制备的协议被报道。为了降低当前文库制备技术的成本和时间限制，我们尝试采用AmpliSeq，一种遵循微型试剂协议的GBS方法，使用蚊子HTS（TTP Labtech，Royston，UK），这是一种正位移移液仪器。蚊子HTS提供从25 nL到1.2μL的高度精确和精确的多通道移液（8或16通道）。蚊子HTS最初用于蛋白质结晶[7]。最近，蚊子HTS和另一种蚊子HV模型已用于单细胞RNA序列分析[8]。蚊子HV作为大容量模型（500 nL至5μL）不能节省足够的试剂，也不能降低AmpliSeq文库制备的成本。在这里，我们描述了一种方法，允许小型化，自动化，成本和时间效率的384井图书馆准备其质量和性能。

从四个大豆品种的幼叶中提取DNA（CV.SOMASARI，CV。SUZUOTOME，CV。Tachiyutaka和CV。丰田）使用基于珠子的方法（化学DNA植物套件，PerkinElmer，W​​altham，MA）与Biosprint 96 DNA机器人工作站的植物套件（Qiagen，Hilden，德国）。基于DIN值（DNA完整性数）评估提取的DNA质量，这是展示使用挂毯4200（Agilent Technologies，Santa Clara，CA）的DNA的碎片范围的指标。通过在485nm下激发样品并测量520nm的荧光强度，用Qubit荧光计（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）测量DNA浓度。仪器用Quant-IT Qubit DSDNA BR和HS Assay套件（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）校准，如制造商的说明。

在本研究中，使用了3072对AmpliSeq引物[6]。其中，96、192、288、384、768、1152、1536、1920、2304、2688和3072个引物组（面板）与每种100 nM的引物混合。这些引物组是从3072个扩增子组中顺序选择的，扩增子数量最少。图1显示了硅放大器的尺寸分布。所有面板中的峰值尺寸约为280 bp（图1）。

使用IONAMPAXISE库套件2.0（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）构建NGS图书馆[4]。为了使蚊子HTS缩小该程序，我们在减少的试剂体积（表1）中测试了改进的方案。虽然使主混合减少分配步骤的数量，但可能发生死体积。因此，模板DNA和将每种试剂手动分配到每排384孔低体积串联稀释（LVSD）板φ[源板]，用于通过蚊HTS（TTP Labtech，Royston，UK），并储存每个板此后在-20°C。

使用硬壳PCR 384孔板（Bio-rad，Richmond，Ca）进行多重PCR，用微水透明粘合膜（应用生物系统）。当使用通用PCR板（微安光学384井反应板，ABI：应用生物系统，福斯特城，加利福尼亚州）时，在PCR期间发现它们在热量中弯曲，导致针头击中底部以停止蚊子HTS在下一次分配FUPA的步骤。

用于多重PCR扩增，使用1个底漆池（96,192,288,384,768,1152,1536,1920,2304,2688和3072个扩增子面板，扩增每种基因组DNA样品（CV.1.188,384,768，768,1262,1536,920,2304,2688和3072个扩增子面板）（COM。威廉姆斯82）10ng。每次反应（表1）[6]。使用单独的GeneAMP PCR系统9700（ABI）以2.4μL（12％体积）进行多重PCR。由于蚊香HTS的最大容量为1.2μL，因此将总反应体积设定为2.4μL，其2x扩增引物的量设定为1.2μL。

在四个样品（CV。aso masari，cv。suzuotome，cv。Tachiyutaka，cv。使用1底漆（384,768,1152,1920和3072扩增子面板）在2.4μl中进行多重PCR（12％）进行多重PCR（12％使用SimpleAMP热循环仪（ABI），体积，2.0μL（10％）和1.6μL（8％）和20μL（100％体积）中的3072个扩增子。在小型化PCR的反应体积中，蒸发和蒸汽损失是至关重要的。然而，微安透明粘合膜（施用的生物系统）可以防止蒸汽损失而无需蒸气锁或矿物油。将反应混合物在99℃下加热2分钟，用于酶活化，然后在99℃下进行16（384-3071个扩增子）或20（96-288扩增子），在99℃下进行15 s和60℃，4最小（96-1536扩增子）或8分钟（1920-3072个扩增子），以10°C的保持周期结束。在55℃下使用0.24,0.2或0.16μLFUPA酶在55℃下消化扩增的样品10分钟，然后在60℃下酶失活20分钟。为了使多个库待加载的每芯片，0.24,0.2或0.16μl独特的稀释混合物，包括Ioncode768条形码和离子P1适配器（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）使用在22℃下为0.24,0.2或0.16μLDNA连接酶1小时，然后在72℃下进行连接酶失活10分钟。图书馆体积高达10μl，低TE。

Williams 82的条形码库由D1000 screenentape与Agilent 4200 TapeStation (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)根据制造商的说明进行了确认。2.4μL扩增96-3072个扩增板的多重PCR反应均成功，但扩增数量超过1920个时，文库大小并不稳定(图2)。

尽管在本方案中，所有的分配步骤都使用了Mosquito HTS纳米升处理，但在该过程中，不能使用蚊子进行磁珠清洗步骤。因此，我们采用手工方法使用agcourt AMPure XP珠子(Beckman Coulter, Brea, CA)进行珠子清洗和尺寸选择。我们使用1.2x (12 μL)的AMPure XP珠进行珠清洗，然后在每个微型库中加入40 μL新鲜制备的70%乙醇。在标准协议中，我们通常使用1.5倍AMPure XP (20 μL库体积)或半倍体积(10 μL)的AmpliSeq library prep[4]，但在小型化协议中仍保留引物和小体积产物(< 100 bp)。采用SPRIPlate 384磁铁板(Beckman Coulter)最小化文库洗脱体积。我们重复洗涤步骤两次，完全去除乙醇，然后风干珠珠3 - 5分钟(可以根据酒精气味判断)，同时将平板放在磁架上。用12 μL低TE从微珠中洗脱文库，将10 μL上清转移到干净的平板上。

为了检查由小型化方案制备的文库的浓度，使用离子库定量试剂盒通过QPCR量化条形码文库。这是使用2.4μL的2x Taqman主混合物，0.24μl的20x离子Taqman测定和稀释的文库进行。将文库稀释500-和1000倍（100μl低TE中的19-100ng文库），将2.16μl稀释的文库转移到384孔PCR板（带条形码的微安光学384-孔反应板，ABI）为塔克曼QPCR做准备。这些试剂也被蚊子HTS分配（每个文库和塔克曼主混合物两次分配两次，因为蚊子HT的上限体积为1.2μL）。作为标准，在相同的板中，将已知浓度的大肠杆菌DH10B离子控制文库的五种稀释液作为标准。在QPCR之后，使用它们的CT值在CT VS LOC的线性回归中计算每个文库的浓度，使用该标准生成。此后，根据文库浓度和扩增子数以等浓度混合每个文库。

用1.5倍体积的AMPure XP Reagent纯化混合适配器连接文库，然后在每个文库中加入新鲜制备的70%乙醇150 μL。洗涤步骤重复两次，完全去除乙醇，微珠风干3 ~ 5 min，平板置于磁架上。用23 μL低TE从微珠中洗脱文库;取20 μL上清转移至干净管中。

根据制造商的指示，使用D1000 Screentape使用D1000 Screentape（Agilent Technologies，Santa Clara，CA）使用D1000 Screentape确定扩增子的浓度和尺寸。在量化后，在模板制备之前将混合文库稀释至100μm的浓度。

接下来，通过添加低TE，四个样品的条形码文库（带有384、768、1152、1920和3072个扩增子面板，在2.4（12%体积）、2.0（10%）和1.6（8%）μL反应体积中）最终组成10μL，并且通过安瓿XP纯化的文库通过qPCR得到确认。虽然图书馆的集中度是7−236nm，16个文库（2.0μL反应体积中有一个文库，1.6μL反应体积中有15个文库）的浓度为0nm（表2）。在2.4μL反应体积中，文库构建的成功率为100%（20/20），与20-μL反应体积中的成功率相似，但在2.0μL和1.6μL反应体积中，文库构建的成功率分别为95%（19/20）和25%（5/20）。文库制备的失败与扩增子和DNA样本的数量无关（表2），表明DNA质量或扩增子的数量不能解释文库制备的失败。在文库制备失败的样本中，TapeStation 4200系统未检测到PCR产物（数据未显示），这表明多重PCR在2μL或更小的小型PCR反应体积中效果不佳。

将质量检查文库汇集到适当浓度，并在如上所述的模板制备之前将混合文库稀释至100 pM的浓度。

在IONTorrent S5系统（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）上测序了最终的库。根据制造商的指导（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA），使用离子厨师仪器和离子S5套件进行乳液PCR组成的模板制剂，含有模板的富集和芯片加载和芯片加载。根据制造商的指示，使用离子520和540芯片（Thermo Fisher Sciencific，Waltham，MA），使用离子粗墩离子S5系统进行500个循环的测序后，根据制造商的说明进行500次循环。

序列数据通过离子Torrent Suite V5.8.0软件映射到大豆基因组参考版本2.0。该软件针对离子映射对准程序（TMAP）V5.8.17和覆盖分析v5.8.0.8插件进行了优化了对准的离子Torrent原始数据分析 - 对齐。

Williams 82用96、192、288、384、768、1152、1536、1920、2304、2688和3072个放大面板平均深度覆盖875个(共18.8 M reads)。目标利率从56.13%(1152扩增子面板)到85.84%(384扩增子面板),和统一的覆盖范围从51.09%(1152扩增子面板)到93.59%(768)扩增子面板(图3)。尽管几乎没有区别的意思是阅读扩增子面板之间的长度,目标利率很低在1152年和1536年的扩增子面板。大于1152的扩增子均匀性较低(图3)。

在总共获得的19,442,437个reads中，有18,792,850个(96.7%)被TMAP定位到参考基因组(图3)。靶上率表示定位到任意目标区域的reads相对于所有定位到参考基因组的reads的百分比。均匀性是指所有目标区域的基础读入深度至少为平均基础读入深度0.2倍所覆盖的基础的百分比。

我们在4个样本中获得了672(共65.9 M reads)的平均深度覆盖，包括384、768、1152、1920和3072个放大面板。在1152放大器面板上观察到低靶上率和均匀性的类似趋势。这些结果表明，靶上率和均匀PCR扩增的差异依赖于面板，试剂的小型化体积不影响靶上率和均匀性。与标准20 μ l的体积相比，平均读长、对靶速率和小型化协议的均匀性没有差异(图3,4)。

这种小型化协议减少了AmpliSeq库准备的成本和时间。使用手动协议，每个库的材料成本（包括试剂、尖端、板和密封等耗材）为9602日元（384个样本约为3687284日元），而使用此小型协议，每个样本的成本降至约1261日元（384个样本约为484325日元），从而使成本节约约86.8%（表3和表4）。

类似地，图书馆准备的自动化系统是节省时间。使用手动协议使用手动制作384个样本的图书馆，需要大约66分钟。

虽然Mosquito HTS将花费几乎相同的时间(大约44分钟)来创建384个图书馆，但我们在自动化系统中不需要太多劳动力。由于移液混合试剂需要时间，然后是单个试剂转移(没有主混合)，很难缩短库准备时间;然而，由于自动移液，处理时间可以大大减少。Mosquito HTS有两种模式:2-way和5-way(可以一次设置2或5个盘子)。使用Mosquito HTS 5-way模式，可以进一步减少劳动力，因为一些板材可以一次设置和连续加工。或者，虽然在主混合料制备时可能会产生死体积，但分配时间会缩短。当处理1000或更多的样本时，死体积对库准备的影响很小。

在这项研究中，我们提出了一种用于扩增库制备的小型化方案。与标准协议相比，我们的协议价格便宜，而不是劳动密集型。经验，当反应体积为2.4L时获得稳定的结果，并且扩增子的数量为1500或更低。多重PCR均匀性和扩增子尺寸差异的影响大于所用和反应体积的热循环仪的影响。小型化似乎使方案更容易受环境因素的影响。

这是首次将Mosquito HTS应用于AmpliSeq超多重PCR方案，并添加到其他现有的NGS库制备方案中[8-12]。在这种小型和自动化的文库制备中使用的Mosquito HTS，可以一次快速处理8个(尖头间距为9.0 mm)或16个(4.5 mm)样本的大量样本，显著节省成本和时间，并允许快速完成大规模基因分型。

然而，这个Mosquito协议有两个局限性。首先，蚊子高温刺激实验应该在一个寒冷的房间里进行，而在本研究中，我们在室温下进行。此外，我们总是使用新制备的试剂。使用前将试剂提前配制到384孔板(源板)中，剩余试剂保存在-20℃，供下次实验使用。随着使用次数和时间推移的增加，在随后的实验中，库的质量下降(一致性较低，数据未显示)。这可以通过在寒冷的房间中使用Mosquito HTS来预防。第二，Mosquito HTS不能用于珠的清理。因此，有必要使用另一种常规点胶机器人[13,14]。作为一种替代方法，采用两步法优化样本池。首先，把所有的文库均匀地混合在一起，并按顺序略读; then, the concentration from the first sequencing result was adjusted and sequenced again. Finally, the initial cost of the robot is high. However, these robots are very useful and greatly reduce the experimental cost if housed in core labs or core facilities.

总之，我们介绍了一种议定书，用于使用SompoliSeq Library套件（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）在小型化体积中准备序列文库。通过本协议，可以在标准试剂体积的仅12％的时间内制备384个文库，其成本的不到13.1％，并且在标准手动协议中不到18.2％的时间。这应该有助于推进不仅临床基因组学，而且还可以在农艺领域和农业等项目等大规模基因分型。

作者要感谢Ayaka Take、Anne Hammerstein (TTP Labtech, Royston, UK)、Masaya Asano、Keishi Nakayama、Masahiro Matsushita和Naoto Momoda，感谢他们在使用Mosquito HTS和HV方面的技术支持。这项工作得到了NARO的资助，以及日本农林水产省的下一代技术先进研究和开发特别计划项目的支持。

作者声明他们没有利益冲突。