介绍：冻融胁迫的耐受性是最近发酵过程中的重要特征。

方法：要深入了解乳酸菌（实验室）的冻融耐受性，进行筛选实验。

结果：筛选实验表明，即使在没有冷冻保护剂的情况下，4种实验室也显示出高冻土。使用16S rDNA的部分测序进行实验室菌株的同源性对准分析。结果表明，3个菌株属于乳杆菌曲肌一个菌株属于Weissella cibaria.。这些磅。Curvatus.在牛奶发酵过程中，菌株也表现出很高的耐冻性。这些数据表明磅。Curvatus.具有其耐受性以冻融应激的特定机制。

结论:这项研究表明磅。Curvatus.菌株常常在培养和牛奶中显示出高水平的冻融耐受性，并且磅Curvatus菌株适合作为研究实验室中的冻融耐受性潜在的分子机制的模型物种和发酵产业中的应用。

乳酸菌;冷冻解冻压力;压力耐受性。

介绍：冻融胁迫的耐受性是最近发酵过程中的重要特征。

方法：要深入了解乳酸菌（实验室）的冻融耐受性，进行筛选实验。

结果：筛选实验表明，即使在没有冷冻保护剂的情况下，4种实验室也显示出高冻土。使用16S rDNA的部分测序进行实验室菌株的同源性对准分析。结果表明，3个菌株属于乳杆菌曲肌一个菌株属于Weissella cibaria.。这些磅。Curvatus.在牛奶发酵过程中，菌株也表现出很高的耐冻性。这些数据表明磅。Curvatus.具有其耐受性以冻融应激的特定机制。

结论:这项研究表明磅。Curvatus.菌株常常在培养和牛奶中显示出高水平的冻融耐受性，并且磅Curvatus菌株适合作为研究实验室中的冻融耐受性潜在的分子机制的模型物种和发酵产业中的应用。

乳酸菌;冷冻解冻压力;压力耐受性。

各种微生物对环境胁迫的响应已引起基础科学和发酵科学的关注。在发酵科学中，对环境胁迫的耐受性是用于发酵的微生物(如乳酸菌(LAB)和酵母)的一个有用特性[2,3]，因为这种耐受性可以改善发酵过程。冻融应激对于最近发展起来的发酵工艺已经变得很重要，作为改进包括乳酸菌在内的发酵食品生产和保存工艺的努力的一部分[4,5]。冻融应激是一种复杂的应激，包括脱水、生理应激、低温和/或氧化应激。

在使用实验室的发酵行业中，首发培养物主要通过冷冻干燥制备[6]。然而，冷冻干燥被认为是昂贵和复杂的过程。对实验室中的冷冻应激的应力耐受机制的见解可能有助于改善存活细胞最大化的起始制剂。

据我们所知，尚未报告尚未报告冻融冻结应力的实验室耐受性的机制。已知冷冻保护剂（例如，甘油和谷氨酸）改善了冻融胁迫后实验室的活力[7,8]。为了深入了解乳酸菌的冻融耐受性（实验室），进行筛选实验，用于确定在不含冷冻保护剂的情况下具有高水平的冰乙虫耐受性的实验室菌株。

实验室菌株（〜70株），原始从发酵食品和植物中分离，用​​作筛选资源。在瑞科松大学的微生物科学实验室保存了这些菌株。

在Anaeropack（Sugiyama-Gen Co.，Tokyo）提供的Anaerobic条件下，在5毫升汤（BD Biosciences，San Jose，CA）下，在30℃下培养了48小时的实验室菌株。将培养物（5mL）在-25℃下冷冻4d，并在30℃下解冻，然后将它们进行相同-25℃冷冻4d，然后在30℃下解冻。有必要进行两次冻融处理，因为当施用单一的冻融处理时未检测到测试菌株之间的显着差异。将部分（100μ）样品接种成5ml新鲜的MRS肉汤，并在厌氧条件下在30℃下培养48小时。光密度为600nm（OD₆₀₀使用分光光度计（Bio Spector，Eppendorf Hamburg，Germany）测量。

通过初级筛选选择的实验室菌株用于二次筛选。在5ml MRS肉汤中，在30℃下培养48小时的菌株。将培养物在-25℃下冷冻4d，然后在30℃下解冻。通过将样品用适当的样品用盐水（0.9％NaCl）在30℃的三次℃下将样品与盐水（0.9％NaCl）合适的稀释剂施加到30℃下，测定样品后的样品的CFU。孵育48小时后，计算活性炭的数量。作为对照实验，CFU也在冻结前的样品中测量。

分类识别：我们通过Kawamoto等人描述的方法对筛选菌株的分类鉴定基于16S rdNA的部分序列。[9]。我们通过开展日本DNA数据库（DDBJ）进行爆炸搜查，确定序列的同源性。使用APE软件进行具有类型菌株的同源校准分析。本研究中获得的实验室菌株的序列沉积在DDBJ中。

在冷冻处理过程中发酵乳的存活率:将乳酸菌置于5 ml MRS肉汤中，30℃培养48 h。离心(3000 g, 10 min)收集细胞，用生理盐水洗涤，加入10 mL含3.6%总脂肪的牛奶(明治，东京)，30℃孵育24 h。将发酵乳(10ml)在−25℃冷冻3 d。用倾注平板法测定了细胞在牛奶或凝固牛奶中的存活能力。简而言之，将部分(100 μ)的发酵乳与MRS琼脂(20 mL)培养基混合，然后倒入有盖培养皿中，一式三份。孵育48 h后，计数活菌落。

作为初级筛选，评估了重复冻融处理后70实验室菌株的生长能力。Lactobacillus delbrueckii.无性系种群。保加者从商业酸奶产物中分离用作对照菌株，它显示了约。0.1的OD.₆₀₀在这些实验条件下。这里测试的几乎菌株显示出较低的OD₆₀₀与控制菌株相比。在所有测试的菌株中，11个菌株显示出一个OD₆₀₀> 0.3;将这11个菌株用于二次筛选。

在二次筛选中，在如方法中所述，在初级筛选中选择的11个污渍的冷冻解冻处理后估计菌落形成单元（CFU）估计（图1）。

冻融治疗前后每种菌株的CFU（图1）显示在冷冻解冻处理之前，菌株的CFU范围为5×10^6.到5×10^8.。控制应变的CFU值磅delbrueckii无性系种群。保加者在冻结之前，冻融治疗大大降至1％之后。三种菌株（IR7，IR8和IR28）的CFU在冻融处理前后没有显着减少（P> 0.05）。IR1，显然更高P.- 比其他菌株比其他菌株，还选择进一步分析。

根据16S rDNA部分序列对4株菌株进行了分类鉴定。序列同源性通过BLAST搜索日本DNA数据库(DDBJ)确定。使用ApE软件与类型菌株进行同源性比对分析(表1)。本研究获得的LAB菌株序列保存在DDBJ中。16S rDNA序列的登录号如下。W. Cibaria.IR1：LC520099。磅。Curvatus.IR7：LC520100。磅。Curvatus.IR8：LC520101。磅。Curvatus.IR28: LC520102。16S rDNA部分测序和同源性分析结果表明，IR7、IR8和IR28是该物种的品系磅。Curvatus.并且Ir1属于物种Weissella cibaria.（表格1）。

生存能力磅。Curvatus.IR7和W. Cibaria.分析含有含糖和脂肪的含水的牛奶中的IR1菌株，因为实验室菌株通常用于产生衍生自酸奶产品如酸奶的发酵食品（图2）。添加后的LB细胞后Curvatus对牛奶，牛奶的强烈凝固被观察到（图2）。相比之下，部分牛奶凝结观察到W. Cibaria.在相同条件下使用IR1。

在-25℃下冷冻处理3d后牛奶或固化乳的细胞的活力估计为细胞/ ml。如图3所示，磅。Curvatus.与...相比，IR8表现出更高的生存能力W. Cibaria.IR1和磅delbrueckii无性系种群。保加者。这些数据建议磅。Curvatus.菌株可用于生产从牛奶中提取的发酵食品。

磅。Curvatus.，与之密切相关乳酸杆菌Sakei.[10]，在各种资源中检测到包括发酵食品和动物肠道，和磅。Curvatus.显示了基因组多样性[11,12]。目前的分析确定了三个磅。Curvatus.具有冻融耐受的菌株。从不同的资源中分离了三种菌株。虽然磅。希西被列入筛选资源，没有磅。松蒂应变在我们之前的实验中被检测为冻结硫化菌株[数据未显示]。

磅。Curvatus.本研究中筛选的菌株是众所周知的，可以产生细胞外多糖（EPS）[13]，可以在冷冻条件下的细胞保护剂中的效用[14]。虽然不完全了解冻融应力的耐受性差异的分子机制，但是磅。Curvatus.具有有助于在三种菌株中观察到的耐受的特定基因和/或细胞系统。

这项研究表明磅。Curvatus.在没有冷冻保护剂的情况下，菌株显示出高水平的冻融耐受性。磅。Curvatus.菌株可以是适合作为模型物种，以澄清实验室冻融耐受性的分子机制以及发酵行业的应用。这磅。Curvatus.菌株还显示出牛奶发酵过程中的高水平冻胀耐受性，表明这一点磅。Curvatus.菌株可用于发酵食品，例如冷冻酸奶。

作者宣布没有本文的作者和/或出版本条的利益冲突。

构思和设计了实验：J Shima，进行了实验：R Ikai和K Tanabe，
分析了数据:R Ikai和K Tanabe，
促成了稿件的写作：j shima，
批评稿件：K Tanabe和R Ikai。