缝隙连接是由连接蛋白组成的蛋白质，参与血管功能的调节。连接素43 (Cx43)的缺失修饰了已知参与调控血管系统、分化和血管细胞功能的基因的表达。有趣的是，缺乏内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因的突变小鼠已被证明为高血压，提示一氧化氮(NO)在血压的生理控制中发挥作用。因此，假设肺血管系统中内皮细胞Cx43的缺失导致内皮功能障碍，导致eNOS损伤，从而减少NO的生物合成，从而导致血管收缩和血管重构，进而导致肺动脉高压(PAH)的发展。本项目旨在评估eNOS基因在Cx43基因杂合(HET)小鼠(Cx43 +/-小鼠)中的表达情况。这是通过四组野生型(W/T)和Cx43 +/-(雄性和雌性)小鼠的肺组织实现的。采用RNA II分离系统从肺组织中分离核糖核酸(RNA)，并逆转录为互补脱氧核糖核酸(cDNA)。采用终点聚合酶链反应(PCR)和实时PCR检测eNOS基因的表达。eNOS基因表达水平在所有四组小鼠中均相同，无显著差异。结果提示eNOS基因在小鼠Cx43基因杂合子中表达(Cx43 +/-)。

连接蛋白，eNOS, PCR，逆转录。

缝隙连接是由连接蛋白组成的蛋白质，参与血管功能的调节。连接素43 (Cx43)的缺失修饰了已知参与调控血管系统、分化和血管细胞功能的基因的表达。有趣的是，缺乏内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因的突变小鼠已被证明为高血压，提示一氧化氮(NO)在血压的生理控制中发挥作用。因此，假设肺血管系统中内皮细胞Cx43的缺失导致内皮功能障碍，导致eNOS损伤，从而减少NO的生物合成，从而导致血管收缩和血管重构，进而导致肺动脉高压(PAH)的发展。本项目旨在评估eNOS基因在Cx43基因杂合(HET)小鼠(Cx43 +/-小鼠)中的表达情况。这是通过四组野生型(W/T)和Cx43 +/-(雄性和雌性)小鼠的肺组织实现的。采用RNA II分离系统从肺组织中分离核糖核酸(RNA)，并逆转录为互补脱氧核糖核酸(cDNA)。采用终点聚合酶链反应(PCR)和实时PCR检测eNOS基因的表达。eNOS基因表达水平在所有四组小鼠中均相同，无显著差异。结果提示eNOS基因在小鼠Cx43基因杂合子中表达(Cx43 +/-)。

连接蛋白，eNOS, PCR，逆转录。

肺动脉高压(PAH)是一种致命的进行性疾病，其特征是肺动脉压持续升高，从而导致右心室[1]衰竭。该疾病病因不明，与肺NO[2]水平低有关，临床表现为通气灌注不匹配、呼吸短促、运动不耐受、昏厥及重者心力衰竭[1,3]。肺动脉从心脏向肺输送缺氧血液，在肺毛细血管内进行气体交换。肺动脉高压是一种多因素疾病，其特征是肺血管的收缩和重塑，这是持续高肺压[5]的基础。血管重塑过程导致平滑肌细胞(SMCs)、肺内皮细胞和成纤维细胞增生增加和紊乱，从而导致远端动脉血管数量减少，这是动脉肌肉化增加的结果，随后进展，导致血管闭塞，最后形成网状病变[6]。

PAH的确切发病机制尚不完全清楚，但血清素、骨形态发生蛋白受体2型和NO通路已被证明在疾病的发生发展中起主要作用[7,8]。需要针对血管收缩和重构的新型药物治疗，这只能在已知的发病机制[5]中实现。

研究表明Cx43的表达局限于肺动脉分支[9]的内皮细胞。小鼠中Cx43基因缺失与平滑肌增殖[10]显著升高相对应。关于Cx43在动物模型中的表达的研究似乎不一致，因为Cx43缺失的不同影响已经被报道[11]。虽然在Cx43敲除小鼠[10]中观察到新内膜和外膜形成增加，但最近的一项研究显示Cx43杂合小鼠中新内膜形成减少(Chadijichristos et al.， 2006)。Cx43的缺失已被证明可以改变已知参与血管细胞分化和功能的基因的表达，以及对血管生成和血管生成[12]调控非常重要的细胞信号通路。由于缺乏eNOS基因的突变小鼠已被证明为高血压，支持NO[13]对血压的生理控制作用，Cx43和eNOS表达[14]之间似乎存在相互作用。

本项目的目的是评估eNOS基因是否在Cx43基因杂合子小鼠(Cx43 +/-小鼠)中表达。使用野生型和Cx43 +/-(雄性和雌性)四组小鼠的肺组织。采用RNA II分离系统从肺组织中分离RNA，逆转录为cDNA。采用终点PCR和实时PCR检测eNOS基因的表达。

该调查符合英国1986年动物程序法，以及美国国立卫生研究院出版的《实验室动物护理和使用指南》(NIH出版物，2011年第8版)。大学伦理委员会给予伦理批准。雌雄野生型和连接蛋白杂合子小鼠43只，在木屑床上饲养，在随机提供食物和水的条件下进行12 h - 12 h的光/暗循环。本研究共选用12只野生型小鼠和12只连接素43只20 ~ 28周龄杂合子小鼠。腹腔注射戊巴比妥钠(60mg/kg i.p;JM Loveridge plc，南安普顿，英国)，肺组织折断冷冻和储存在-80ºC，直到进一步使用。组织标本标记如表1所示。

使用德国machery - nagel GmbH & Co. KG公司提供的NucleoSpin®RNA II试剂盒从小鼠肺组织中分离总RNA。在从肺组织中提取RNA的过程中，首先，从100%乙醇原液中制备70%乙醇。用数学方程M₁V.₁= M₂V.₂，将式交叉相乘，得到乙醇中加入水使其浓度达到70%的体积。V.₁=所需原液体积=M₂V.₂/ M₁=（70x100）/ 100 = 70ml。因此，将70ml股票乙醇用30毫升稀释，浓缩至70％。此外，通过将10μl重构的RDNase加入到RDNase的10μl重构的RDNA酶至90μL反应缓冲液中，在EPPendorf管中制备DNase反应混合物，足以用于所有样品。将反应混合物短暂地涡旋并储存在冰上，并且当需要时，将来自其95μl加入到每个RNA样品中。将每个解剖（约10mg）组织置于含有3个金属珠粒，320μL裂解缓冲液Ra1和3.5μLTCEP的裂解管中。使用快速准备-24均化器（MP生物医学英国），组织被破坏并均质化，因为它们在速度5时3次裂解了20秒。每次裂解组织时，将裂解管除去并置于冰上1分钟，以防止过热。将裂解物加入到核棘柱过滤单元中，然后将其置于2ml收集管中。在以13,000rpm以13,000rpm离心1分钟后从裂解物中萃取RNA。通过在去除过滤单元后，通过将320μl70％乙醇加入到收集管中的每个均化裂解物中来调节RNA结合条件。 The content of the collection tubes were properly mixed by pipetting up and down for 5 times, using a pipette man. This was then transferred to a NucleoSpin RNA column in a 2ml collection tube alongside precipitate which had formed. The samples were centrifuged for 30 seconds at 10,00rpm and the flow-through discarded.350 μl of membrane desalting buffer (MDB) was added to the NucleoSpin RNA column and centrifuged at 13,000rpm for 1 minute and then the flowthrough was discarded. To digest the DNA, 95μl from the DNase reaction mixture was added directly onto the centre of silica membrane of each of the columns and was then incubated at room temperature for 15 minutes. The silica membrane was washed and dried by first adding 200μl RA2 to each of the spin columns and centrifuging them for 30 seconds at 10,000rpm. This was shortly followed by placing the columns in fresh collecting tubes. Furthermore, 600μl buffer RA3 was added to the columns in the fresh tubes and then centrifuged for 30 seconds at 10,000rpm. The flowthrough was discarded and the columns dried completely by further adding 250μl of RA3 buffer and centrifuging it for 2 minutes at 13,000rpm. Buffers RA2 and RA3 are wash buffers. While RA2 was used to inactivate the rDNase, the more concentrated RA3 was used to efficiently wash the inner rim and dry the membrane completely. The columns from the collection tubes were removed and transferred to a 1.5ml Eppendorf tube and 60μl RNAse free water was added directly onto the column membrane. The membranes were completely covered and then centrifuged at 13,000rpm for a minute. The columns were discarded and the tube containing the eluted RNA samples kept on ice before being stored at -20 oC till the next day.

为了避免RNA的污染和降解，在处理RNA样本时，应确保佩戴手套并经常更换手套。此外，反应总是被制备并保存在冰中，从而防止RNA降解。

使用NanoDrop®ND-1000 UV/V分光光度仪软件(Thermo Fisher Scientific Inc.， Waltham, MA, USA)对RNA样本进行定量，然后计算反转录所需的组织体积。纳米滴落装置的光纤测量表面首先用酒精清洗，以避免污染。然后用1μl RNAse游离水直接滴在光学测量表面上进行消隐。然后点击空白，确保波长设置为零，这是测量样品的吸光度背景。每个样品测量一式两份，读数见表2。为了知道每个样品的用量，根据最低浓度(85ng/μl)的样品进行计算，并加入所需的水体积使组织标准化(表2)。

所使用的精密nanoScript 2 RT试剂盒由英国南安普顿的Primerdesign有限公司提供。将冷冻的试剂解冻并进行短暂离心，而将其余的试剂放在冰上。将RNA样本9μl (85 ng/μl)、随机六聚体0.5μl和Oligo dTs 0.5μl分别加入0.2ml的PCR细管中，最多可达10μl。每个样品上盖，并放置在PCR机(Biometra GmbH,Göttingen，德国)中，编程将样品加热到65℃，加热5分钟，这是退火温度(根据制造商的协议使用)。5分钟后，取出样品并立即放在冰上冷却。在薄壁的0.2 ml PCR管中制备RT母混合。对于每个RT反应，在冰上向每个样品中加入10μl的主混合物。将样品盖上盖子，在脉冲旋转后进行短暂旋涡，在PCR仪上按如下方式孵育:25℃5分钟，42℃20分钟(扩展步骤)，72℃15分钟(灭活步骤)。PCR完成RT过程后，从机器中取出cDNA样本，在-20℃下保存，待进一步使用。

根据需要，将储存的cDNA各转移3μl到新鲜PCR管中。用RNAse游离水27μl稀释cDNA，使其达到30μl。从30μl稀释的cDNA中，将5μl转移到0.2ml新鲜PCR管中。将稀释后的cDNA保存在-20℃备用。

用于扩增cDNA及其预期产物长度的引物由applied Biosystems™(Roche molecular systems, Inc.， Branchburg, USA)提供，其给出如下:eNOS正向引物:5'GATATCTCGGGCAGCAGCTT ' 3 (424 bp);β-actin正向引物:5'CCCTGAACCCTAAGGCCA ' 3，反向引物:5'AGGATTCCATACCCAAGAAGGAA ' 3 (489 bp)(图1)。eNOS引物以25 nmol粉末状传递，因此与1000μl RNAse游离水重组，最终浓度为25pmol/μl。

对所有24个样品分别配制了25μl Reddy mix、0.3μl正向eNOS引物和0.3μl反向引物的主混合料。将主混和物旋涡混合，将其中的26 μl加入到PCR管中5 μl的cDNA中。将试剂混合并进行短暂离心，以确保内容物在管的底部。以26μl的主混合和5μl的RNAse游离水代替cDNA模板作PCR阴性对照，确保引物和Reddy mix均不受DNA污染。将试管转移到PCR机中，在95℃条件下编程2分钟(初始变性步骤)，34 ×(94℃条件下30秒(变性步骤)/55℃条件下60秒(退火步骤)/72℃条件下60秒(延伸步骤))，72℃条件下编程10分钟(最终延伸步骤)。同时对管家基因β-Actin进行RT-PCR，每个cDNA样品中添加0.6μl β-Actin。在PCR结束时，cDNA样品被提取并保存在-20℃。

用含有4μlmidoriGreg（Nippon Genetics Europe GmbH，Düren，德国）和0.5x Tbe（Tris / Borate / EDTA）溶液的1％琼脂糖凝胶对凝胶电泳分析检查扩增基因和高漆器的特异性稀释后。5X TBE由27克的TRIS基础粉末组成，13.5g粉末硼酸和1.6ml液体乙二胺四乙酸（EDTA），这些都从Fisher Scientific英国Ltd.，Loughborough，英国购买。将10μl100bp乳蛋白（Norgenbiotek Corp.，Thorold，On，Canada），20μl阴性对照和20μl与eNOS基因孵育的所有cDNA样品中的每一个一起加载到凝胶罐上，并在120伏特下电泳45分钟。使用上面详述的方法再次对β-肌动蛋白进行电泳，但用5μl100bp的乳蛋白IV（Bioline Realgents Limited，伦敦，英国），因为它是唯一可用的高背体。使用带有图像Lab™软件（Bio-Rad Laboratories Ltd，UK）的分子成像仪®GELDOC™XR +系统拍摄凝胶，结果如图2所示。

所使用的引物以及2x qPCR主混合试剂盒均购自英国南安普顿的Primerdesign Ltd.。首先,进入新的PCR管在冰上,2μl每个存储cDNA稀释了18μl核糖核酸酶游离水,从96年1.5μl被转移到一个好板一式三份实时PCR(图1)。PCR -控制没有cDNA也在一式三份为1.5μl核糖核酸酶游离水。以5μl 2x主混料、0.5 μl eNOS引物和3μl水组成的主混料，仅能处理21个样品。将主混合液旋回，将其8.5 μl加到含有1.5 μl cDNA的96孔板上。该板覆盖了一层薄膜，并使用Allegra X-22R离心机(Beckman Coulter Ltd.， High Wycombe, UK)进行短暂离心，以确保内容在板的底部。随后将平板放置在ViiA™7 Real- Time PCR系统(Life Technologies Ltd, Paisley, UK)中，并编程在50℃循环2分钟，95℃循环10分钟，40 x循环(95℃循环15秒/ 60℃循环1分钟)。50度步骤需要激活尿嘧啶n -糖基化酶(UNG)和清除任何污染。95度步骤10分钟是Taq激活步骤，同时变性UNG。在95°C下15秒，dsDNA模板变性。Taq对引物的退火和延伸发生在60°C 1分钟。 Realtime PCR was also done using the housekeeper, ubiquitin C (UBC) primer. The different templates of the gene served as coding and non-coding strands, with only the non - coding strand being transcribed during PCR as it contains the anticodons (John and Igor, 2006). The 2 x qPCR master mix used was labelled with ROX™ fluorescent dye. The qPCR links the amplification of DNA to the generation of fluorescence of ROX dye and was detected during each PCR cycle in real time. The higher the amplified DNA, the higher the intensity of the fluorescence [15]. At the end of the qPCR, the data wasfirst analysed on Microsoft office Excel 2010 (Microsoft Corporation, Redmond, USA). The quantitation cycle (CT) values for all the samples were obtained. The delta delta (ΔΔ) CT method was applied in calculating the change in gene expression. For example, for HET male 1, the average eNOS CT value for the triplicate was 27.665. Average UBC CT value was 24.308. Therefore, ΔCT value for HET male 1: GOI (HET male1) – HK (HET male 1) = 27.665 – 24.308 = 3.357. With the Excel, the average ΔCT values for all HET male were obtained and used in calculating the ΔΔCT values for all other groups. Using GraphPad Prism™ (GraphPad Software Inc., La Jolla, USA), data was collated and relative eNOS gene expression presented on a bar chart while statistical analysis was done using two-way ANOVA (Figure 3).

结果以均数±均数标准误差(SEM)表示，n为终点PCR和qPCR小鼠数量。对于终点PCR，通过观察条带并将其与100bp超梯进行比较，直观分析基因表达。在qPCR中，eNOS基因表达采用双因素方差分析，然后进行多重比较试验，比较基因型和表型的基因表达水平。p < 0.05被认为是显著的。

为研究eNOS基因在杂合cx43小鼠中的表达情况，采用终点PCR法检测eNOS基因。eNOS和β-Actin转录本进行PCR分析。eNOS的PCR分析显示，eNOS仅在W/T雄性和HET雌性中可见，且条带大小为200bp。然而，与超梯相比，这与预期的424 bp大小不同(图2A)。虽然β-Actin在大多数样本中表达，但W/T女性不可见。检测到的β-Actin大小为600bp，也与预期的489bp大小不同(图2B)。阴性对照组未检测到条带。

为了提高效率和可靠性，采用qRT - PCR检测扩增基因产物的特异性。在相对于UBC的肺组织中检测到eNOS基因(图3)。通过两种方法的方差分析，我们发现eNOS基因表达在所有四组小鼠模型中均无显著差异:HET男性(1.0±0.19,n = 5), W / T男性(0.86±0.35,n = 6), HET女性(1.04±0.14,n = 5)和W / T女性(0.82±0.16,n = 5)。HET (Cx43)男性和HET (Cx43)雌性老鼠显示约等于以挪士基因表达水平与W / T同行相比。eNOS在W/T男性和W/T女性中的表达水平无变化。在95%置信区间进行统计分析时，eNOS基因表达在性别(P = 0.98)和基因型(P = 0.43)中均无显著差异。

本研究检测基因杂合子Cx43 (Cx 43 +/-)小鼠中eNOS基因的表达，将小鼠分为四组:W/T雄鼠、Cx43 +/-雄鼠、W/T雌鼠和Cx43 +/-雌鼠。RT - PCR首次对小鼠肺组织eNOS的表达进行了研究。由于条带与eNOS基因的预期大小(434bp)不一致，提示eNOS引物没有从cDNA中提取eNOS基因。同时，由于阴性对照孔不含任何cDNA，因此不显示任何条带。管家基因在人类和动物的细胞维持中是必不可少的，并被认为在所有细胞中保持恒定的表达水平，因此，被用作基因表达[16]的正常化标准。β-Actin在大多数样品中表达，但少数样品不可见，提示cDNA不足或污染。β-肌动蛋白大小的差异也可能是由于引物没有选择该基因。琼脂糖凝胶电泳法测定eNOS基因表达速度快，易于浇注，但不适用于低分子量样品[17]的分离，因此需要进行qRT - PCR。UBC被证明存在于检测的目标DNA中，并被用来确认qRT-PCR过程是否正常工作。由于eNOS基因表达水平没有变化，因此提示Cx43杂合子小鼠(Cx43 +/-小鼠)eNOS表达(可能是其信号通路)没有受损。 Also, gender does not affect eNOS expression as there was no observed change in its expression in both genders. This observation was however not consistent with a recent study by Ruiz-Holst et al., [18] in which sex-dependent alterations of eNOS protein expression in cardiac tissues of male and female W/T mice with heart failure was investigated. Female W/T mice eNOS protein expression levels and activation was shown to be higher than W/T males, and the difference could be due to the presence of eNOS de-phosphorylating calcineurin- A found in W/T males [18].

最近的研究表明Cx43在血管壁[19]中协调细胞增殖和迁移是必不可少的。这在Cx43基因敲除小鼠的平滑肌细胞中得到了证实，其中新生内膜和外膜加速生长[10]。糖尿病诱导的cx43表达抑制增加了糖尿病小鼠视网膜内皮细胞的血管细胞凋亡。与正常血压对照[21]相比，边缘性高血压大鼠(P<0.05)和自发性高血压大鼠(P<0.05)中cx43的定量表达显著降低。Cx 43表达的减少有助于血管细胞壁的重塑，也影响缝隙连接的通讯，这在完全正常的高血压大鼠[21]中更为明显。这表明SMC的加速生长与Cx43的缺失有关。然而，另一项发现显示cx43杂合子小鼠[22]内膜形成减少。有趣的是，Cx43在小鼠内皮细胞中的缺失导致低血压[23]，因为Cx43在慢性缺氧大鼠[24]的肺动脉中表达上调。而当一氧化氮合酶被抑制[25]时，大鼠主动脉中Cx43的表达降低。内皮细胞(EC)特异性缺失Cx43的小鼠内皮细胞[26]之间的Ca2+通信严重减少。 Since NO biosynthesis in the EC depends on activation by Ca^２＋-钙调素复合物，由于有证据表明缺乏eNOS基因的突变小鼠似乎是高血压[13]，Cx43和eNOS表达之间的联系已经建立，但尚未确定途径。由于血管连接蛋白不是单独作用的，修饰一个连接蛋白的表达可能会影响另一个[27]的表达，也可能影响eNOS基因的表达。

考虑到Cx43缺失在动物模型中的不同作用，以及eNOS基因在小鼠中的表达，因此，在了解PAH的致病基础方面，未来的工作值得推荐。活性氧以及caeolin -1和其他Cx与eNOS的相互作用影响eNOS活性[23]，在研究更大的小鼠模型群体中eNOS的表达时应考虑到这一点。这些相互作用是如何导致PAP升高的，我们可以通过对被调查小鼠的肺组织进行血流动力学测量来测量。

综上所述，本研究结果表明eNOS基因在W/T小鼠和Cx43杂合小鼠(Cx43 +/-小鼠)中均有表达。eNOS基因的表达水平不受性别影响，Cx43参与了PAH的发生发展。尽管eNOS突变小鼠似乎会发生高血压，但Cx43和eNOS信号通路在肺血管中的相互作用似乎是复杂的。基于这些证据，eNOS与其他连接蛋白的相互作用，以及这些相互作用如何影响eNOS的表达，可能导致PAH的发生，还有许多途径需要进一步研究。

作者希望感谢河流州可持续发展署(RSSDA)的善意支持，通过为我的整个学习期间提供资金。最后，我把荣耀归给上帝，因为他在我在英国期间的保护、怜悯和信实。