MinION纳米孔测序仪已向社区测试人员发布，用于各种测序应用程序的评估。小黄人曾被用于评估上呼吸道疾病感染，并被发现具有巨大的野外应用潜力。在本研究中，我们通过靶向测序和全基因组测序测试了MinION对临床细菌和病毒样本的准确识别和区分能力。目前的纳米孔技术在错误率方面存在局限性，但随着新的流动细胞和库套件的发展，纳米孔技术已经稳步改善。上呼吸道疾病微生物成功测序、鉴定和分化到菌株水平，与我们的参考基因组数据库的比对率为87-98%。这项研究提供了测序用于识别和区分临床样本中存在的病毒和细菌物种的证据。

上呼吸道疾病小黄人测序急性呼吸道感染H1N1

MinION纳米孔测序仪已向社区测试人员发布，用于各种测序应用程序的评估。小黄人曾被用于评估上呼吸道疾病感染，并被发现具有巨大的野外应用潜力。在本研究中，我们通过靶向测序和全基因组测序测试了MinION对临床细菌和病毒样本的准确识别和区分能力。目前的纳米孔技术在错误率方面存在局限性，但随着新的流动细胞和库套件的发展，纳米孔技术已经稳步改善。上呼吸道疾病微生物成功测序、鉴定和分化到菌株水平，与我们的参考基因组数据库的比对率为87-98%。这项研究提供了测序用于识别和区分临床样本中存在的病毒和细菌物种的证据。

上呼吸道疾病小黄人测序急性呼吸道感染H1N1

急性呼吸道感染（ARI）是几个世纪以来军队疾病的重要疾病和非伤害。虽然来自ARIS的死亡率在军事群体中较低，但这些感染在失去工作时间和康复方面对军事准备的影响很高。此外，新的ARIS是一种周期性的发病率和死亡率，例如在1918年A / H1N1（“西班牙语”）流行性流行病中，2002 - 2003年的亚洲和北美的严重急性呼吸综合征（SARS）流行病，以及2009-2010猪来源A / H1N1全球大流行。近年来，腺病毒的周期性爆发和类似的感染具有困扰的军事培训中心，控制其在最近被疫苗的不可用力受到阻碍[1,2]。支持病毒感染在培训和准备中发挥重要作用的观点，其他研究表明，学员的ARI率为80％，住院率为20％[3-5]。尽管侵略性的疫苗接种计划，但ARI已被认为是在手术沙漠风暴期间的美国空军飞行员接地的70％的原因[6]。虽然流感通常是捕捉世界关注世界的病原体，但其他呼吸道病原体最近才获得了军队的注意。腺病毒导致各种症状，来自结膜炎，肠胃炎和轻度呼吸道感染，在免疫流血血统中的血流和脑感染的年轻成年人中对生命的肺炎肺炎。中东呼吸综合征 - 冠状病毒（MERS-COV）爆发[7]以及中国的H7N9流感疫情[8]将我们的注意力集中在新的和新兴病原体上，这些病原体可以被引入免疫学幼稚群体或重组 into novel forms through human-human or human-animal transmission.

下一代测序（NGS）技术现在能够为各种生物体提供全基因组序列或偏见组，[9-15]。在临床微生物学实验室中的频率增加频率以检测和表征病原体，从而取代目前使用的Sanger测序方法[8,16,17]。Sanger测序是一种可靠且坚固的方法，在几十年内提供了临床实验室;然而，它是劳动密集型，慢，并且不容易适应加工大型基因组或大型样品套。上呼吸道疾病（URD）病毒的表征肯定会受益于全基因组测序（WGS）和靶向测序的使用，为我们提供高度多样化的病毒基因组的工具[18-20]。这些数据可以有助于疫苗发育，检测抗病毒耐药性，或鉴定新的新兴重新分类病毒基因组。这些进步可能有助于减轻流感淫亵或季节性病毒流行病的发病率和死亡率。

因此，牛津纳米孔的MinION可能为我们提供了跟踪传染病的新机会，例如，病毒基因组的快速测序将使我们能够跟踪流感大流行的早期阶段，或确定疫情期间出现的冠状病毒基因型。此外，测序将使我们有机会了解病毒的遗传漂变(单核苷酸多态性)、新毒株的出现，如sars样冠状病毒或中东呼吸综合征冠状病毒，以及传播模式。到目前为止，已经用MinION进行了一些致病性病毒研究[18,21-26]。宏基因组NGS在发热性疾病监测方面尤其具有吸引力，因为该方法可以广泛检测该领域临床样本中的病毒、细菌和寄生虫[1,7,27]。虽然目前受限于sample-to-answer周转时间> 24小时台式测序,我们报告在这项研究中,无偏病原体检测使用目标和全基因组测序可以实现与可操作的结果为临床诊断(19日,20日,23日,25日,26日,28 - 32)和公共卫生(30)22日,28日在10 h。

像Illumina MiSeq和Life Technologies Ion Torrent这样的NGS平台已经被广泛用于提供病毒的WGS数据，可能在收到[7]样本的2-3天内。因此，便携式NGS仪器显然是有市场的，它可以部署到现场进行监测，使用现成的现场工具包、一次性流动池(Flongle)和测序试剂，其成本可与台式测序仪相媲美。此外，测序数据的分析使用联网笔记本电脑实时完成。MinION已成功用于WGS和靶向测序[8,33,34]，WGS非常适合于研究遗传多样性水平高、使用靶向测序方法难以获得的URD物种[23,25,26]。本研究的目的是检验使用MinION对URD临床样本中存在的URD生物进行测序的有效性。

甲型流感病毒H1N1 (VR1736)、副流感病毒1-3 (VR94、VR92和VR93)、冠状病毒229E和OC43分离株(vr740和VR1558)、肺炎支原体(ATCC 29342)、流感嗜血杆菌病毒(51907)和人腺病毒(VR-1603)均从美国型培养标本(ATCC)中分离得到。从这些生物体中分离的核酸作为文库制备的对照核酸(NA)，并在文库制备过程中加入作为内部控制。采用Maxwell总病毒核酸试剂盒(Promega, Madison, WI)从200 μL病毒上清液或临床洗鼻液中提取RNA/DNA，用50 μL RT PCR分子级水(Thermo Fisher Scientific, Waltham,MA)洗脱。经鉴定为阳性的鼻腔冲洗剂来自赖特·帕特森空军基地的临床实验室。本研究使用的临床分离物为甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒1-3、腺病毒和冠状病毒OC043。

根据制造商的说明书，使用SuperScript III OneStep RT-PCR系统(Thermo Fisher Scientific)，使用表1所列引物进行靶向RNA PCR。简单地说，每50 μ l反应使用10 ng无DNA RNA或无RNA DNA。所有PCR反应均在10 uM、每个引物1.0 ul下完成。RT-PCR热循环参数如下:30分钟在50°C, 2分钟在95°C,然后35周期30年代在95°C, 30年代在52°C,和75年代在72°C,然后最后一个扩展在68°C的5分钟。PCR NA从细菌或DNA病毒完成使用AccuStart II PCR Supermix(量子生物科学,贝弗利,MA)推荐的制造商。循环条件为:95°C变性3分钟，94°C变性30秒，55°C变性30秒，72°C变性90秒，25次循环，72°C变性3分钟。DNA或cDNA PCR反应使用1.5X agcourt Ampure XP珠纯化(制造商(Beckman Coulter, Indianapolis, IN))，并使用Qubit 4.0荧光仪定量)，使用DNA高灵敏度试剂盒。(热费希尔科学)。

这项工作是作为ONT派对早期访问计划的一部分完成的。在此期间，在两年的研究期间流动细胞，流动细胞化学物质和库套件变化了许多次数。用于制备图书馆的ONT型碎序列套件如表3所示。DNA或cDNA文库在整个研究中用各种流动细胞进行测序，包括r7，R7.3和斑点9.4。随后的流动细胞数增加表明其流动细胞的改善，具有斑点R9.4流动细胞是最新的改进。此外，在本研究期间提出了套件改进（KIT：R7.03流量细胞和试剂盒的套件：SQK-LSK-209，SQK-LSK-209，SQK-LSK-209，SQK-RAD 004（RIFE）的套件改进，将改变为KIT改进。4或斑点R9.4流量细胞）。通过使用条形码试剂盒（Exp-PBC001）完成DNA片段的条形分子。用于每个测序库的库套件如表2和表3所示，以及起始材料和流动细胞类型的量。牛津纳米孔技术（ONT;牛津纳米孔技术，牛津，英国）沟序列测序试剂盒用于制备制造商所述的DNA和RNA文库。简而言之，DNA或cDNA以6,000rpm剪在G型管（Covaris）中剪切。使用Nebnext FFPE修复混合物（新英格兰Biolabs [Neb]），Ipswich，MA）修复了碎片的DNA。 After 15 min of incubation at 20°C with FFPE repair buffer and FFPE repair mix, the repaired DNA was purified using AMPure XP beads in a 1:1 ratio, washed with 80% ethanol, and eluted with nuclease-free water. The DNA fragments were end repaired and deoxyadenosine (dA) tailed using the NEBNext end repair/dA tailing module (NEB). DNA was mixed with DNA CS (positive-control strand), Ultra II end prep reaction buffer and enzyme mix and incubated for 5 min at 20°C and 5 min at 65°C in a thermocycler. DNA was purified using AMPure XP beads in a 1:1 ratio, washed with 80% ethanol, and eluted with nuclease-free water.

将端部DNA与发夹适配器和NEB钝头/TA连接酶主混合(NEB)室温孵育15分钟，然后加入发夹栓，室温孵育10分钟。文库与珠结合缓冲液洗涤My One streptavidin C1珠(Invitrogen, Carlsbad, CA)在室温下以1:1比例孵育5分钟，用珠结合缓冲液洗涤，并在装载前用洗脱缓冲液洗脱。使用Qubit 4.0荧光仪和DNA高灵敏度试剂盒进行定量(Life Technologies)。将文库转移到1.5 ml低结合的Eppendorf管中，置于冰上，直到装载到流池中。

使用来自临床分离株的全基因组Na制备Rapid 1 D库（ONT R9版本; SQK-RAD004）。全基因组产品用Covaris G-Tube（Woburn，MA）剪切，其碎片尺寸约为5kb。通过在30℃下与碎片混合物（FRM）孵育1分钟，然后在75℃下在热循环液中孵育1分钟，在75℃下进行两百纳米DNA。然后通过在室温下与快速适配器混合物（rad）和NEB Blunt / Ta连接酶主混合物温育和NEB Blunt / Ta连接酶主混合物并直接加载如制造商所述的测序来连接到衔接子。

使用Minion Control Software，Minknow版本1.1-1.3.24，用于R9流量细胞的流量控制软件7.3和Minknow版本1.4.6.-2.4.5来启动48小时的排序方案。使用WIMP应用程序（在我的罐中更新为EPI2ME的版本0.46.1.9版本0.46.1.9版本，后来更新为EPI2ME），读取事件数据被称为。

如前所述，使用与MinION测序实验相同的提取NA完成靶向RT-PCR扩增。用于靶向RT-PCR的引物如表1所示。使用Nextera XT文库准备试剂盒(Illumina, San Diego, CA)制备Illumina MiSeq测序库。每个文库加1 ng DNA到10 ul的RSB缓冲液和5 ul的ATM中。该反应混合物在55°C孵育5分钟，以标记DNA，然后用5 ul的NT缓冲液中和。标记的DNA片段用独特的条形码引物进行索引，并在50 ul反应混合物中进行PCR扩增，如下所示:72°C 3分钟,30年代95°C,和12个周期95°C的10年代,55°C 30年代和72°C 30年代,紧随其后的是72°C 5分钟。PCR清理是由添加30 ul AMPure XP珠子(贝克曼库尔特,沥青,CA),其次是7分钟的孵化和两个洗液和80%乙醇洗脱RSB的35 ul。所有分离株的Nextera文库在Illumina MiSeq仪器上使用600-cycle reagent kit v. 3 (Illumina)在300-cycle模式下对端进行多路测序。使用Qubit 4.0荧光仪和DNA高灵敏度试剂盒(Thermo Fisher Scientific)对文库制剂进行定量。

读取数据从原生HDF5格式(Fast 5)中提取，并使用poretools[4]和序列读取进行质量评估，并使用Nanofilt[36]剔除q-score低于4的质量读取。Kraken和Bracken生物信息学软件包用于比对由真菌、病毒和细菌基因组组成的数据库[32,37-39]。从NCBI Ref Seq(2015年5月)下载所有基因组、病毒和细菌，构建Kraken数据库(版本0.10.4)，k=31。Bracken (Bayesian Reestimation of Abundance after classification with Kraken)估计宏基因组样品中的物种丰度。Bracken[38,40]用于重新分配物种水平的比对，并使用Krona[40]使用最高命中数(最低e值)或Metrichor的WIMP应用程序实现可视化。使用Fast QC评估Illumina读数的质量，并使用以下设置修剪Trimmomatic 0.36:修剪读数:Leading: 3, Trailing: 3，和Sliding Window: 4:15。我们的内部管道使用Kraken和Bracken对读取进行对齐，数据使用KRONA[40]进行可视化。Burrows-Wheeler Alignment MEM (BWA;与Human GR2)和SAM工具提取统计数据和每100个碱基的错误率[41,42]。序列读取被过滤为人类序列，并在可视化之前删除。 Tables 2 and 3 list the analysis tools used for each data set. Read percentage identity is defined as 100 * matches/ (matches + deletions + insertions + mismatches). Fraction of reads aligned are defined as (alignment length + insertions - deletions)/ (alignment length + unaligned length - deletions + insertions).

本研究采用URD病毒(甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒1、副流感病毒2、副流感病毒3、人腺病毒D、冠状病毒OC043和细菌株(肺炎支原体和流感嗜血杆菌)。从每个样品中提取相同的NA用于生成Oxford Nanopore MinION和Illumina MiSeq的库。所有列出的生物体都在MinION上成功测序，并使用WIMP应用程序正确识别，该应用程序使用基于云的参考数据库。图1显示了表1中列出的甲型H1N1流感分离物的数据分析的典型示例。此外，使用BWA MEM和SAM工具对表2中列出的每个分离株进行验证[41,42]。BWA MEM比对结果与表2中列出的每个洗鼻样品的Metrichor鉴定结果一致。

MinKNOW生成的Fast 5文件使用Poretools[24]转换为FASTQ，然后FASTQC文件，使用Kraken进行裁剪、对齐，并使用KRONA使用我们的内部管道进行可视化[38,40]。例如,表2显示顺序读取从114年的甲型流感H1N1 cDNA导致生成高质量的读取这些读取对齐(87.3%)和104年甲型H1N1流感(表2)。奴才序列数据为乙型流感病毒,副流感病毒1 (PAIV1)和冠状病毒OC043百分之一的身份98.7,18.6和91.2,(表2)。有趣的是，测序数据质量在比对误差方面存在微小差异。甲型H1N1流感、乙型流感、副流感1(PAIV1)和冠状病毒OC043的比对误差分别为1.15E-01、1.54E-01、2.74E-02和1.37E-01(表2)。这可能是由于在文库制备过程中，连接步骤中NA片段与适配器比例不合适所致。

从临床鼻洗涤和分离的RNA（200ng / UL）或DNA（200ng / UL）中萃取Na在文库制剂中。使用直接cDNA测序试剂盒来制备RNA进行测序。在装载到R9.4流动细胞上之前，个体文库以等于摩尔浓度混合。读取到参考基因组的百分比对准范围为92-96％（表3）。在测试的生物体中，读取的数量有些不同，并且可能由于在池中定量输入库的错误而导致。未来的条形码汇集方案应包括在汇集之前更准确地计算NM浓度的片段长度的挂毯或生物分析仪（Agilent）量化。Metrichor的云归良叫WIMP应用程序正确识别了库池中的每个生物（图3F）。表3中列出的所有URD生物都使用我们的克拉肯/ Bracken管道重新评估，以验证Metrichor的识别并与Krona进行可视化（图3A-E）。

H.使用ONT的快速1D文库制剂试剂盒制备流感和冠状病毒229e文库。这些数据显示，Rapid 1D套件是一个适用于以前使用的ONT的2D套件的合适替代工具包。测序运行是RAN 17.5小时，他的分离物的总碱产量为4490万，以6的质量得分为中心（图4）。H.使用基于云的Metrichor的WIMP应用（图4A）正确识别了甲酰胺酶，并且通过我们的克拉肯/蕨菜管道验证了读取的对齐，并用Krona进行了可视化（图4B）。Coronavirus 229e也使用Metrichor的WIMP应用程序识别（S1）。用公式C = Ln / g的H型流感和冠状病毒229e计算覆盖范围，其中C =覆盖，L =平均序列读取长度，平均长度n =读数，G =基因组大小。H.Compenenzae和冠状病毒229E基因组覆盖率分别为约186倍和170倍。

在MinION纳米孔测序仪上采用全基因组测序和扩增子测序完成URD病毒和细菌的测序。在现场收集和分析样本时，能够在一个移动的、占地面积小的平台上对扩增子和整个基因组进行测序是很有吸引力的，而且随着测序方法向环境和监测应用的发展，这些品质也是值得期待的。这些方法、数据和结果代表了MinION纳米孔测序技术的一个实用和新颖的应用。本研究中的数据是由R7.3和9.4化学流细胞生成的，它们准确地识别了一组URD生物。随着MinION技术的改进，测序通常会变得更便宜、更快、更准确，正如本研究中所证明的那样，随着新的流动细胞和试剂盒的释放，错误率有所提高，校准百分比>92%(表2和3)。

Minion Nanopore测序器的基本呼叫分析是主动开发面积，以及流动单元配置，套件协议以及相关的试剂盒化学品。最佳质量序列数据被称为2D读取，而1D读取来自模板股线。数据质量有所改善，并在本研究中展示了套件化学和流动细胞类型的每种改进。本研究表明，该平台可以应用于3小时运行时间的快速微生物检测，提供足够的数据以产生可靠的识别。作为测序产量，质量和周转时间继续改善，预计纳米孔测序将攻击诸如PCR等主干以鉴定未知样品。

纳米孔和短读测序数据（Illumina Miseq）的比较表明，鉴定了主要的分类单位有一致。因此，本研究中描述的方法表明，整个基因组测序和靶向测序均可用于临床样品中的微生物和病毒多样性的快速，准确，有效地检测。在研究病毒遗传重排和病毒中的遗传漂移时，WG的使用也是有益的[43,23]。此外，这些数据还支持利用针对性测序对所需监测的现场应用的深度测序。

尽管发现纳米孔测序仪产生的长序列与台式测序序列相比有相对较高的误差率。然而，MinION测序已经被证明具有显著的优势，如便携性、低成本和实时检测。然而，用扩增子测序对低滴度样本(如洗鼻液)进行测序比培养更可取，并将提供一种快速识别临床样本中的微生物的方法。这项研究表明，少量的长reads足以准确识别小基因组和新流细胞和化学物质(Spot-On 9.4)，测序数据的错误数量有所提高(表2和3)。

快速1D试剂盒是由模板链组成的单链库，用于评估快速处理的宏基因组样品。快速1D文库的使用表明，在追踪急性感染或监测期间需要快速识别病原体时，它在功能上是一个游戏规则改变者。当使用传统的细胞培养技术鉴定困难或在某些情况下没有靶向方法时，这种方法特别有用。通过宏基因组测序建立一个快速微生物鉴定系统似乎是合适的，特别是对于现场应用[44-48]。

在现场收集和分析样本时，能够在一个移动的、占地面积小的平台上进行测序是很有吸引力的，随着测序方法向占地面积更小的测序器(SmidgION)发展，这些品质也是值得追求的。便携式MinION和SmidgION测序技术在现场应用中具有显著的优势，可以实现快速样本应答功能，无需将样本运送回实验室。

这项工作得到了国防健康计划和莱特·帕特森空军基地首席科学家办公室的支持^TH.人类表现翼，俄亥俄州。作者承认Craig Slapple先生进行生物信息学分析的贡献。