细菌性阴道病是育龄妇女的一种常见疾病，与潜在的严重副作用有关，包括早产风险增加。近年来微生物组测序技术的进步使人们对细菌性阴道病的复杂机制有了新的认识，并产生了新的诊断方法。在这里，我们报道了一种基于10种潜在致病菌和4种共生乳酸菌的相对丰度的定量分子诊断算法的验证，该算法在研究对象(n=172)中被分类为症状(n=149)或无症状(n=23)。我们观察到，通过该算法诊断的患者中有一个清晰而强化的模式，这与目前对感染期间阴道微生物群的生物动力学和失调的理解一致。使用这种对感染基础生物学的增强评估，我们证明了与当前诊断工具相比，诊断灵敏度(93%)和特异性(90%)提高了。我们的算法似乎还提供了增强的诊断能力，对诊断和医疗决策复杂的模糊类别的患者，包括无症状患者和那些被纽金特评分为“中间”的患者。最终，我们将CLS2.0q建立为细菌性阴道病临床诊断的定量、敏感、特异性、准确、稳健和灵活的算法——重要的是，它也非常适合临床表现相似的非bv感染的鉴别诊断。

细菌性阴道病，分子诊断工具，微生物组。

细菌性阴道病是育龄妇女的一种常见疾病，与潜在的严重副作用有关，包括早产风险增加。近年来微生物组测序技术的进步使人们对细菌性阴道病的复杂机制有了新的认识，并产生了新的诊断方法。在这里，我们报道了一种基于10种潜在致病菌和4种共生乳酸菌的相对丰度的定量分子诊断算法的验证，该算法在研究对象(n=172)中被分类为症状(n=149)或无症状(n=23)。我们观察到，通过该算法诊断的患者中有一个清晰而强化的模式，这与目前对感染期间阴道微生物群的生物动力学和失调的理解一致。使用这种对感染基础生物学的增强评估，我们证明了与当前诊断工具相比，诊断灵敏度(93%)和特异性(90%)提高了。我们的算法似乎还提供了增强的诊断能力，对诊断和医疗决策复杂的模糊类别的患者，包括无症状患者和那些被纽金特评分为“中间”的患者。最终，我们将CLS2.0q建立为细菌性阴道病临床诊断的定量、敏感、特异性、准确、稳健和灵活的算法——重要的是，它也非常适合临床表现相似的非bv感染的鉴别诊断。

细菌性阴道病，分子诊断工具，微生物组。

细菌性阴道病(BV)被广泛认为是育龄妇女中最常见的阴道疾病[1]。在从3700名妇女中自我收集的阴道拭子样本中，BV的患病率在14-49岁的普通人群中估计为29%，在非裔美国妇女中为50%[2]。通常，受影响的患者表现为阴道炎症，可导致分泌物、瘙痒和疼痛。也就是说，临床表现可能有很大差异，无症状感染非常常见[2]。BV的各种危险因素已经被注意到，包括性活动[3,4]，其他性传播感染[5]的存在，以及种族和民族[2]。BV感染的重要并发症包括孕妇早产风险增加[6]和艾滋病毒获得和传播[7]。在一些妇女中，即使采用标准护理，也难以清除感染，往往导致慢性或复发症状[8]。

由于活动性感染可能导致生活质量下降，以及bb0妇女中BV的高患病率，改进的BV感染检测策略一直是很多讨论的主题。最近技术的进步推动了人们对基于dna的定量诊断算法的兴趣，这种算法理论上比培养更快，结果更准确，而且有可能成为定点护理设备。然而，BV感染看似复杂的生物学和动力学，以及“金标准”方法的重要局限性，使这些努力复杂化。

一个混淆因素是一致的观察，BV与单一的致病病原体无关，而是与微生物种群中广泛的破坏性转变有关:从一个健康的乳酸菌为主的环境，到一个很大程度上被有机体所取代的环境，如加德纳菌、各种支原体和混杂的偶发性厌氧菌[10]。随着这种转变，不同生物之间潜在的相互作用发生了变化，当地细菌群落产生的代谢物发生了变化，宿主的免疫反应也发生了变化。这些因素共同产生了感染的主要体征和症状。这种疾病表现的动态机制导致一种具有复杂病因学所有标准特征的情况。例如，BV在临床上表现为多种方式，个别症状可能是阴道微生物组的多个系统转移的结果，有利于各种致病有机体。有时妇女没有任何临床症状;事实上，相当大比例的感染患者是无症状的[11,12]。在怀孕的情况下，这一统计数据尤其重要，因为已经证明BV感染，无论是否有症状，都与早产[6]有关。

此外，阴道菌群最近被证明在健康个体中是纵向动态的;也就是说，在几天和几周的时间里，可以看到几乎实时的变化。微生物种群通量对细菌群落内稳态的维持、感染后症状的缓解以及对无症状女性症状的抑制的影响还不清楚。然而，经常变化的微生物群给准确诊断带来了困难，因为有效的分子检测依赖于在单一时间点采集的样本。

鉴于导致临床表现的动力学的复杂性，BV感染的诊断历来是一个挑战也就不足为奇了。虽然革兰氏染色+ Nugent评分[14]被认为是金标准，但它是一种充满问题的技术:

鉴于目前已知的与疾病相关的微生物组改变的复杂性，这些缺点中的第二个可能解释了纽金特[14]的低敏感性和特异性。最后，Nugent评分也被证明偶尔会错过鉴别诊断，如阴道毛滴虫感染[16]，由于不适当的治疗对患者的健康有潜在的问题影响。

阿姆塞尔标准的应用是一种更古老、更常用的诊断工具。该试验首次描述于1983年，要求至少满足BV诊断的四个标准中的三个标准:pH升高(>4.5)，特征分泌物，向切片制剂中添加10% KOH时的鱼腥味，以及湿支架[17]中“线索细胞”(粘附在上皮细胞上的较小细菌)的显微镜可见性。然而，尽管Amsel的标准在理论上很容易实现，但据报道在临床环境[18]中没有得到充分利用，而且在技术上受到了缺乏考虑健康乳酸菌种类[19]的丰富程度的限制。

这些和其他公认的BV金标准诊断技术的失败，最近推动了利用新技术寻找替代方案的研究。今天，市场上有各种各样的替代方案，它们声称易于测试，增强敏感性和特异性，以及降低成本。在护理点(PoC)可以使用的药物相对较少[20,21];更确切地说，大多数可用的检测方法都需要将样本(通常以阴道拭子的形式)送到实验室进行检测。虽然不像PoC诊断那样方便，样品运输和测试后1到2天就能得到结果，而PoC结果需要几分钟到几小时，但将样品引用到外部实验室有几个关键优势。最值得注意的是，一些临床实验室可以同时对样本进行广泛的微生物靶点筛选，覆盖多种情况，而不仅仅是BV。对有症状的患者来说，提供鉴别诊断的能力是一个关键优势，因为BV以外的感染可以表现出非常相似的体征和症状。许多实验室还可以生成细菌特异性存在/缺失或半定量信息，同时也可以检测难以培养的、厌氧和共生微生物。这样的数据为医疗保健提供者提供了可能，因为他们经常需要对模糊的体征和症状进行解释，从而获得更清晰的诊断。类似地，他们可以被提醒混合/混合感染，据报道这种情况影响20%的BV+患者[22]。 Finally, providers can potentially receive specific recommendations for therapy (e.g. antibiotic regimens or combinations of treatment options specific to the pathogen(s) detected). While in no way a replacement for a thorough physical examination and detailed capture of patient history [23], such molecular-based screening holds great promise for the enhancement of the current standard-of-care.

在这里，我们提出了对BV现有定量分子诊断方法的改进和性能评估，该方法消除了Amsel和Nugent检测所显示的挑战，同时也通过属和种特异性信息为致病菌和非致病菌提供了准确的诊断。这种基于实时聚合酶链反应的检测以高度可定制的格式提供，允许各个实验室根据未来的需要和研究进展增加或减少内容。该方法还允许同时筛查各种其他阴道病原体，无需额外的劳动或消耗品需求，从而实现鉴别诊断——这是该测试比目前PoC解决方案的一个附加价值。

作为之前BV诊断算法开发工作的一部分，我们对已发表的关于正常和致病阴道菌群的研究进行了全面回顾。我们的调查包括通过下一代测序来描述BV+和BV-女性微生物群的文献[13,18,24,25]，基于分子的BV诊断工具开发的调查[1,9,15,26-28]，以及这两个主题的专家综述[29-33]。我们发现，大量研究表明，特定细菌的数量——而不仅仅是它们的存在或缺失——在BV的发展和/或持续中起着作用[1,9,15,18,28,29,32,34,35]。最终，选择了14种与bv相关的微生物(表1)，这些微生物理论上可以最大化诊断特异性，同时对临床实验室保持成本效益，将它们纳入新的诊断试验中。基于TaqMan®的分析是在ThermoFisher生物信息学管道的协助下设计的，可检测细菌特异性基因，直到物种水平，据报道，每个微生物都存在一个副本，这一事实对每个微生物目标的相对丰度计算很重要。随后，检测结果被放入定制设计的TaqMan OpenArray板的通孔中，用于阴道菌群调查(可从ThermoFisher Scientific获得)。

由于细菌性阴道炎、念珠菌病和滴虫病都表现在阴道炎中，临床表现出类似的体征和症状，并且经常在合并感染的患者中观察到，因此将针对这些感染的特异性分析添加到分组中，以帮助鉴别诊断。此外，由于白色念珠菌感染的治疗方法与非白色念珠菌感染不同，因此在最终的面板设计中也包括了5种特定的酵母。

在最初的算法设计阶段，将几种统计和算法方法应用于患者样本(410 antibiotic-naïve，包括25名无症状女性，根据Amsel的标准分析无线索细胞)，并对敏感性和特异性进行评估。其中包括一些多元线性和混合模型以及各种其他技术。一般来说，线性回归技术在敏感性(即识别BV+个体的能力)方面表现不佳，但在特异性(即排除BV作为诊断的能力)方面表现相当好。替代策略，例如产生最终CLS1算法的策略，显示了整体性能的提高(特别是灵敏度的提高)，尽管特异性略有降低。最终，使用相对丰度测量的性能最高的定量模型被选择用于验证，而不是仅基于存在/缺失数据的定量模型。

随后，共有172名研究对象(149名有症状的女性和23名无症状的女性)被招募到一项临床研究中，旨在验证现有的专有诊断算法(CLS2.0q)。所有人都在生育与不孕研究所(San Fernando, CA)注册。不包括18岁以下或在过去30天内服用过抗生素的患者。记录患者种族、年龄、妊娠状况、月经状况、细菌性阴道病、念珠菌病复发史及节育方法。Nugent评分也进行了每一个。入组患者平均年龄30.4岁;91.8%自认为是西班牙/拉丁裔。

与用于算法开发的人群一样，在验证人群中使用COPAN ESwab™和绒毛尼龙纤维头[36]从阴道外侧壁和后穹窿或盲阴道拭子中收集了3个样本。两根棉签被转移到1毫升改良的液体艾米斯运输介质中，并在室温下运送到实验室进行DNA处理。用棉签将收集到的样品转移到三个载玻片上。

用标准显微镜技术检查了一张载玻片阴道毛滴虫和线索细胞。第二张幻灯片通过加入10% KOH溶液的气味测试来检查，并检查其特有的强烈的鱼腥味。第三张切片被送到Primex临床实验室(Van Nuys, CA)，由对样本供体的临床表现一无所知的病理学家和技术人员进行独立评估。

病理学家和技术人员将纽金特评分方法[14]应用于从每个患者收集的样本的涂片。简单地说，棉签在玻片上滚动;然后热固定涂片，革兰染色。随后对涂片进行以下形态类型的评估(油浸1000倍放大):大革兰氏阳性棒(乳酸菌形态型)，小革兰氏变棒(G. vaginalis形态型)，小革兰氏阴性棒(拟杆菌属物种形态型)，弯曲革兰氏变棒(Mobiluncus物种形态型)。Nugent评分用于诊断细菌性阴道病。对于4-6分“中间”的样本，Amsel 's四项标准中的三项(灰白色均匀阴道分泌物、pH≥4.5、嗅嗅试验阳性、有无线索细胞)被用作BV的诊断标准。

在分子分析中，DNA分离使用MagMAX™Express 96半自动样品准备系统，结合MagMAX™DNA多样品超试剂盒(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)和标准协议。接下来，在384孔板中使用2.5 μL 2X OpenArray®基因表达Master Mix与2.5 μL洗脱DNA结合，并使用AccuFill™(ThermoFisher Sc.)自动移液仪添加到OpenArray板中，对多个重复进行实时PCR。根据制造商的推荐条件，在QuantStudio 12K Flex OpenArray Real-Time PCR系统(ThermoFisher Sc.)上循环使用OpenArray板。循环后，使用QuantStudio软件分析数据并导出。当给定的微生物特异性分析至少50%的技术重复产生Crt值≤31时，样本才被计算为真阳性。此外，任何16S rDNA对照未能达到21的最小阈值的样本都被拒绝，因为较高的值表明样本收集不足。根据每个靶点的Crt值计算每个bv相关细菌检测的相对数量。

来自149名有症状女性和23名无症状女性的临床样本进行了14种不同细菌种类(表1)的相对丰度测试，这些细菌种类被选择来提供阴道微生物组的临床显著代表。基于这些数据，使用先前开发的专有定量分子诊断算法CLS2.0q诊断患者为BV+或BV-(图1a)。与金标准纽金特试验相比，评估其敏感性和特异性，发现分别为93%和90%。

当将诊断结果与观察到的细菌丰度变化进行比较时，出现了几个明确的模式。首先，BV+女性被发现具有相对较高水平的多种病原微生物。在BV+和BV-患者之间没有单一的生物完全分化;相反，几种微生物(特别是巨噬菌1、BVAB2、阴道棘球蚴和阴道棘球蚴)的联合存在有助于明确的疾病信号。此外，在BV+患者中还观察到非致病性共生乳杆菌物种的同时缺乏。总之，这些模式在CLS2.0q诊断BV时相互加强，与先天生物学预期和先前的分析一致(图1a)。相比之下，被诊断为BV-的女性表现出完全相反的模式。具体来说，BV-患者通常表现出相对高丰度的多种假定有益的乳酸菌，同时缺乏致病菌，特别是在BV+患者中最常发现的高水平的致病菌(如Megasphaera1, BVAB2;图1 a)。这些模式共同构成了CLS2.0q在临床有症状和无症状女性中诊断BV的主要信号。

有趣的是，非致病性大肠杆菌在许多患者中是相对丰富的，无论他们的诊断。这表明，无论是大肠杆菌的存在和数量与BV的诊断无关，还是更有趣的是，它在疾病与健康状态的细菌群落中扮演着不同的角色。事实上，先前的研究表明，l.ers在致病感染[37]的早期过程中扮演着“哨兵”或“过渡”物种的角色，并可能在之后以相对较高的丰度持续存在。无论如何，这种患者之间的丰富模式可能对诊断信号没有显著贡献。同样，阴道G.虫，P. bivia和U .解脲常在BV+和BV-患者中发现。这也表明它们对疾病的诊断作用不大。相反，这种模式很可能反映了有益菌群处于平衡状态的自然动态，抑制了致病菌的爆炸性增长。

检测中包括了几种相对很少观察到的致病菌(如巨噬菌2和木氏乳杆菌)。尽管这种罕见，但很明显，它们对上面讨论的总体模式有贡献。事实上，它们对诊断的最大贡献可能是它们在BV患者中明显的缺失。

在数据分析过程中，确定了20名Nugent得分为中等的受试者。这类患者在目前的诊断实践中是一个不明确的类别，治疗指南也不明确。有趣的是，通过上述相互加强的模式，CLS2.0q似乎为此类患者提供了明确的解决方案(图1b)。具体来说，该算法约有一半(n=9)被诊断为BV+，一半(n=11)被诊断为BV-。

经进一步检查，验证数据集(N=23)中的所有无症状女性通过纽金特分析显示有BV的一些证据。具体来说，16个得分为“高”，其余7个得分为中等。没有一个得分是“低”。有趣的是，其中4名女性被CLS2.0q诊断为BV+，所有这些都是Nugent中间细胞，但被显微镜医生指定为“很少”线索细胞。

念珠菌病、滴虫病和5种特定念珠菌的检测被纳入最终的面板设计，以实现这些感染的鉴别诊断，因为它们的临床表现相似(表2)。

育龄妇女的患病率在29%至50%之间，每年有相当数量的妇女受到细菌性阴道病感染的负面影响。感染与严重的潜在副作用有关，包括在怀孕期间受感染的妇女早产风险增加。然而，这种情况的复杂病因——多种不同的细菌组合与破坏的阴道微生物群有关的方式——直到最近才开始得到重视。此外，患者表现出广泛的临床症状，从完全无症状到表现出多种体征和症状。其他人实际上感染了其他病原体，导致类似的症状和体征。潜在病因的动态和高度交互的性质和复杂的临床表现使准确诊断和鉴别诊断成为挑战。

因此，改进的检测BV感染的策略一直是很多讨论的主题。测序技术的最新进展已经开始揭示与疾病相关的生物学，也显示出改善诊断的巨大希望。他们甚至打开了开发个性化治疗方案的大门，该方案基于细菌相对丰度增加和减少的实际组合。

在这里，我们描述了一种新的分子诊断，基于阴道微生物组的多重致病和共生有机体的相对丰度的定量测量。它不依赖于培养、显微镜或染色模式的主观分析。相反，在观察到的每一种测定微生物的水平中相互加强的模式准确地捕捉到阴道微生物组的生物学复杂性，并清楚地区分BV阳性和BV阴性患者。

BV感染背后的复杂生物学表明，准确的诊断方法必须同时考虑到多个有机体的平衡。历史上，像Amsel标准这样的方法是通过大量的临床观察和测试来完成的，或者通过细菌染色和其他以实验室为基础的技术，如纽金特评分。然而，这些方法对某些诊断特征利用存在/缺席判定，而对其他方法仅提供患者的半定量分类。这些限制导致金标准方法的分辨率较低。具体来说，纽金特评分提供了一个有点模糊的“低”、“中等”或“高”的结果，而不是一个更具体的诊断“BV+”或“BV-”。

与现有的替代方法相比，我们在这里验证的诊断方法似乎更准确地捕捉到BV的复杂生物学特性。它明确了多致病性和共生型乳酸菌的丰度增强模式(见图1a)，即使在诊断不明确的“中间型”患者(图1b)，也能提供清晰和准确的诊断。该方法还提供了比目前标准护理诊断工具更好的灵敏度和特异性。有趣的是，这些指标可能低估了真正的积极和真正的消极个体的数量，因为算法必须与一个已知缺陷的标准进行比较。有可能这些缺陷产生的性能上限与CLS2.0q产生的清晰信号无关。因此，CLS2.0q诊断算法的实际敏感性和特异性可能比报道的要高。

CLS2.0q除了为模棱两可的纽金特“中间”受试者提供清晰的信息外，在无症状患者中似乎也表现良好。这一点尤其有价值，因为有充分的文献记载，大多数BV病例没有任何临床症状。有趣的是，大多数参与验证的无症状患者通过CLS2.0q诊断为BV+(图1c)。同样，通过清晰解释的生物模式识别，CLS2.0q似乎也有助于此类患者的准确诊断，尽管需要对这一亚组进行更多的研究来确认这一观察结果。

CLS2.0q除了改善了对阴道微生物组失调的生物学一致性、患者特异性模式的捕获外，还结合了一些现有方法的技术改进。例如，与检测技术一起，它能够识别目前被标准诊断方法遗漏的稀有和难以培养的有机体。此外，与以前的方法相比，开放阵列技术提供了几个关键优势。这包括增加微生物靶点选择的灵活性，提高微生物鉴定的准确性和高通量能力。随着未来的研究继续揭示感染的潜在动态，它们还允许改进平台内容。

尽管如此，CLS2.0q算法的成功验证在几个方面受到了限制。首先是在172名女性的验证集中，总体样本量有点小。然而，尽管验证数据集可能看起来有限，但原始训练集包括410名有症状和无症状的女性，在原始算法开发期间的所有发现都与这里展示的非常相似(数据未显示)。第二个限制是该研究的患者样本有些偏颇。鉴于本数据集中的大多数受试者自认为是拉丁裔，理想的验证应该包括所有种族的代表性样本，以完全控制组间已知的和潜在的差异。一项理想的研究还应该完全控制地理位置和社会经济地位。然而，研究对象的可获得性和其他后勤挑战限制了收集工作只限于一个地点/卫生系统，而该系统的人口可能不能充分代表国家一级的人口。

另一个限制是这种情况本身的生物学特性所固有的，即阴道微生物群的实时动态，由于采样时的失调状态，不可避免地会引入变异。虽然在我们的分析中没有正式解释，但在开发和验证中显示的算法的鲁棒性强烈表明，我们已经采样了足够多的失调状态，以反映该方法检测到的大部分相关生物变异。

最终，该验证确立了CLS2.0q作为一种定量、敏感、特异性、准确和健壮的细菌性阴道病诊断算法。在鉴别阴道微生物群失调的潜在生物动力学方面，它明显优于金标准方法。它能够对临床表现相似的多种其他疾病进行有效的鉴别诊断。最后，未来的工作可能允许该算法扩展到个性化治疗方案的数据驱动推荐，包括那些可能有助于避免和/或避免抗生素耐药性的方案。正在进行的研究有望发现更多与细菌性阴道病相关的生物体，CLS2.0q有望在未来的算法改进中迅速包含这一信息。

很明显，定量诊断方法提供了关键的改进，目前的方法诊断和治疗复杂感染。希望这里使用的技术将使护理点兼容的周转时间，并扩大这些技术在个性化医疗中的影响。除了灵活性和效率外，这些方法也有可能识别耐药有机体，从而为个别患者提出具体和个性化的治疗方案。此外，这些技术可用于检测和诊断其他疾病，如呼吸道感染、胃肠失调和伤口愈合问题。

作者感谢ThermoFisher科学公司对获取用于训练和开发CLS2.0q算法的数据的支持。