Crotalus durissus terrificus蛇毒(CdtV)的主要毒素是Crotalus croissus croficus蛇毒(CdtV)，具有抗炎和免疫调节作用。尽管CTX对中性粒细胞迁移和吞噬有抑制作用，但它并不直接影响中性粒细胞产生活性氧(ROS)。相反，它能促进巨噬细胞产生活性氧和氮中间体。鉴于巨噬细胞-中性粒细胞相互作用在先天抗菌防御中的重要性，本研究的目的是通过CTX处理的巨噬细胞共培养或CTX处理的巨噬细胞的条件培养基，研究CTX对中性粒细胞ROS产生和杀伤活性的影响。结果表明，CTX对中性粒细胞的功能以及中性粒细胞与巨噬细胞的相互作用具有重要的调节作用，如过氧化氢、次氯酸、一氧化氮和TNF- α的产生增加，以及中性粒细胞的杀真菌活性增加。

响尾蛇毒素，巨噬细胞，中性粒细胞，炎症，ATP，活性氧和活性氮，细胞因子，共培养模型。

Crotalus durissus terrificus蛇毒(CdtV)的主要毒素是Crotalus croissus croficus蛇毒(CdtV)，具有抗炎和免疫调节作用。尽管CTX对中性粒细胞迁移和吞噬有抑制作用，但它并不直接影响中性粒细胞产生活性氧(ROS)。相反，它能促进巨噬细胞产生活性氧和氮中间体。鉴于巨噬细胞-中性粒细胞相互作用在先天抗菌防御中的重要性，本研究的目的是通过CTX处理的巨噬细胞共培养或CTX处理的巨噬细胞的条件培养基，研究CTX对中性粒细胞ROS产生和杀伤活性的影响。结果表明，CTX对中性粒细胞的功能以及中性粒细胞与巨噬细胞的相互作用具有重要的调节作用，如过氧化氢、次氯酸、一氧化氮和TNF- α的产生增加，以及中性粒细胞的杀真菌活性增加。

响尾蛇毒素，巨噬细胞，中性粒细胞，炎症，ATP，活性氧和活性氮，细胞因子，共培养模型。

巨噬细胞与中性粒细胞的相互作用涉及两种细胞的相互激活[1,2]，并在抗菌防御中发挥关键作用[2,3]。中性粒细胞和巨噬细胞具有某些独特和互补的特性，使它们能够协同作为先天免疫的效应器和调节剂[2,4]。巨噬细胞-中性粒细胞合作的基本机制是将ROS、RNS和细胞因子等杀微生物化合物从活化的巨噬细胞转移到中性粒细胞，从而调节后者的反应[1]。

中性粒细胞比巨噬细胞产生更高水平的ROS。此外，其他抗菌因子如髓过氧化物酶在单核细胞中要么不存在，要么很少存在，这导致与中性粒细胞相比，单核细胞的杀微生物能力较弱[1,5,6]。在针对病原体的炎症反应中，巨噬细胞和中性粒细胞之间的合作通过NADPH氧化酶复合物改善ROS的产生，并增加活性氮物种(RNS)的数量，特别是一氧化氮(NO)，导致形成更有效的抗微生物分子，如过氧亚硝酸盐[3,7]。巨噬细胞-中性粒细胞相互作用还涉及两种细胞上表达的PRRs (PAMPs受体)的参与[8]，并由IL-8、CCL2、IL-1 β和TNF- α等细胞因子介导[9,10]，进一步放大炎症反应[11]。

一些研究表明Crotalus durissus terrificus蛇毒的主要毒性成分Crotoxin (CTX)具有抗炎和免疫调节的潜力[12-15]。1938年由Slotta和Fraenkel-Conrat首次分离[16]，1956年由Fraenkel-Conrat和Singer在结构上进行了阐明[17]，CTX是一种β -神经毒素异二聚体，由两种不同亚基- crotapotin (CA)和磷脂酶a非共价结合形成₂(中国人民解放军₂- CB)。通过随机组合CA (CA1、CA2、CA3和CA4)和CB (CBa2、CBb、CBc和CBd)亚型，鉴定出16种不同的CTX亚型。这些异构体的组合形成不同的复合物，具有不同的生物学和药理学特性[18]。

体内和体外研究均表明，CTX对巨噬细胞功能具有双重作用，如抑制巨噬细胞的扩散和吞噬，刺激H₂O₂以及NO的产生和释放[13,19]。这些变化伴随着关键糖酵解酶活性的增加以及葡萄糖和谷氨酰胺消耗的增加，这证明了该毒素的代谢作用[20]。CTX还能增强巨噬细胞中ROS、RNS和细胞因子的产生，从而诱导M1或炎症表型，增强其抗肿瘤和抗利什曼原虫特性[13,14]。相比之下，CTX抑制卡拉胶或FMLP等诱导的中性粒细胞的迁移和吞噬，并下调Syk-GTPase通路[15,21]。CTX对中性粒细胞功能的这种抑制作用有助于其抗炎作用，这是之前报道的[12,15]。此外，与对巨噬细胞的观察结果相反，在卡拉胶诱导的腹膜炎模型中，CTX不影响中性粒细胞代谢(即PMA诱导的ROS的产生)，也不影响其杀微生物活性[21]。

由于CTX选择性地刺激巨噬细胞，并且巨噬细胞和中性粒细胞之间的相互作用导致相互刺激，因此CTX处理的炎性巨噬细胞是否能够改变共培养中性粒细胞的代谢和功能，这就产生了问题。因此，本研究的目的是研究CTX诱导的巨噬细胞激活是否会引起中性粒细胞更有效的杀真菌反应。在与ctx处理的巨噬细胞共培养后，我们能够证明中性粒细胞对白色念珠菌的体外杀真菌活性增强。我们的研究结果强调了这种毒素在研究炎症反应的发生机制以及先天免疫中中性粒细胞和巨噬细胞相互作用的调节方面的潜力。

本研究选用体重160 ~ 180克的雄性Wistar大鼠。所有动物实验均按照动物实验指南进行，并得到Butantan研究所动物使用伦理委员会的批准(CEUAIB，协议号832/11和1013/13)。

按照Rangel-Santos等人先前的描述[22]，使用FPLC系统(瑞典乌普萨拉Pharmacia)的Mono-Q HR 5/5柱对粗毒液溶液进行阴离子交换色谱分析，并使用NaCl (0-1 mol/L, 50 mmol/L Tris-HCl, pH 7.0)线性梯度洗脱不同馏分(1 mL/min)[23]。得到三个峰(p1, p2和p3)，其中p2对应纯CTX部分(约占粗毒液的60%)，峰1和3包含其他CdtV毒素。在合并之前，用非还原性SDS-PAGE(12.5%)[24]和磷脂酶A检测含有CTX的组分的同质性₂活性通过使用合成显色底物的比色法进行评估，如我们小组先前所述[13,19,25,26]。

根据动物伦理委员会协议(832/11和1013/13)的建议，在CO中对大鼠实施安乐死₂打开腹腔，用10 mL pH值为7.4的冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗。轻轻按摩腹壁后，抽吸含有巨噬细胞的腹膜液。对腹膜细胞总数进行计数，并用全色染料染色的涂片进行鉴别计数[27]。所有的测量都使用了来自单个动物的样本。如我们之前的研究[13,19,25,26]所述，检测总是重复进行。

腹膜渗出物如我们组先前所述[21]。大鼠腹腔注射卡拉胶(Cg-4.5 mg/kg) (Sigma, St Louis, MO, USA)， 4小时后安乐死。用PBS冲洗腹膜腔，轻柔按摩腹壁后，抽吸含中性粒细胞的腹膜液。腹膜细胞总数和差异计数[27]显示95%的细胞为中性粒细胞[21]。

中性粒细胞-巨噬细胞共培养方案改编自Hauptmann等人的方法[28]。将常驻巨噬细胞悬浮于含有10%胎牛血清和抗生素(青霉素50 U/ml、链霉素50 μ g/ ml)的RPMI 1640培养基中，浓度为4 × 10⁶/mL，接种于24孔板。细胞粘附1小时后，清洗细胞，用CTX (0.3 μ g/mL或12.5 nM)在5% CO下孵育2小时₂37℃。细胞清洗1次，去除CTX，用含有5μg/ml LPS的新鲜培养基培养24 h，收集LPS条件培养基(CM)。腹膜炎中性粒细胞以4 × 10的密度悬浮⁶在CM(中性φ:CM-Macr φ接触)中进行单培养，在完整的RPMI培养基中播种到炎性巨噬细胞单层中进行共培养(中性φ:Macr φ接触)，或在含有5 μ g/mL LPS的完整培养基中进行对照单培养。培养24 h后，收集中性粒细胞测定ATP、h₂O₂、HOCl、NO和细胞因子水平及杀真菌活性。所有实验均采用三种不同动物的巨噬细胞和中性粒细胞进行。CTX的浓度和毒素孵生时间与以往研究相同[13,19,21,25,26]，并且根据台盼蓝排除试验(Trypan blue exclusion test)没有细胞毒性(图1)

H的产量₂O₂根据Pick等人的描述[29]，基于辣根过氧化物酶(HRP)依赖的酚红转化为有色化合物的H₂O₂。培养24 h后，将收获的中性粒细胞以4 × 10的密度重新悬浮⁶在含有140 mM NaCl, 10 mM磷酸钾缓冲液pH 7.0, 5 mM葡萄糖，0.28 mM酚红和8.5 U/mL HRP的苯酚红溶液(PRS)中，Hank 's溶液的最终体积为7.4 mL。以PRS溶液为空白，连续稀释H₂O₂在PRS中制备5 ~ 40 μ M的标准曲线，以含有100 ng肉豆酸酯phorbol acetate (PMA)的中性粒细胞悬液为阳性对照。96孔平底组织培养板(康宁，NY®)每孔各镀100微升溶液，在37°C的潮湿气氛中孵育1小时。加入10 μ L的1n NaOH停止反应。用Titertek Multiscan分光光度仪在620 nm处测定H2O2依赖性酚红氧化。H的浓度₂O₂表示为H₂O₂每4 × 10⁵细胞。

次氯酸产量(HOCl)的测量方法由dyypbukt等人[30]描述。共培养24 h后，收获中性粒细胞和4 ×10⁵细胞重悬于250 μ L含有140 mM NaCl、10 mM KCl、0.5mM MgCl的5mM牛磺酸(Sigma)溶液中₂、1mm氯化钙₂1 mg/mL葡萄糖和100 ng/mL PMA，在37℃、5% CO条件下孵育1 h₂。为了评估HOCl的基础产量，采用了pma -阴性对照。加入20 μ g/mL过氧化氢酶(Sigma)停止反应，将样品置于冰浴中浸泡10 min。样品离心后，收集上清，取50 μ L 2 mM 3,3 '，5,5 ' -四甲基联苯胺(TMB;每个样品加入含有10 μ M KI和10% DMF的Sigma)溶液，在400 mM醋酸缓冲液pH 5.4中。孵育5分钟后，用5mm牛磺酸溶液组成的空白溶液，在650 nm处分光光度法测定TMB的还原。用标准曲线测定HOCl浓度，以每4 × 10的HOCl微摩尔数表示⁵每小时中性粒细胞。

将收集的中性粒细胞重新悬浮在100 μL 1% Triton-X中，并通过热休克(冷热交替暴露三次)裂解以释放ATP。裂解液离心后，将10 μ L上清液移至白底96平孔板(Corning, Costar)的每孔中。用厂家提供的ATP溶液进行连续稀释，制备标准曲线。ATP测定试剂盒(A22066, Molecular Probes®)按照制造商的说明使用。简单地说，每孔加入0.1 M DTT(二硫苏糖醇)，然后加入100 μ L 10 μ M荧光素酶/荧光素试剂溶液。在反应缓冲液上以20 s为间隔测量10 min的ATP释放，最大发射波长为560 nm。利用标准曲线计算ATP浓度，并以每1 × 10的纳米摩尔ATP表示⁶Sakaki等人[31]所描述的细胞。

为了测量NO的产生，将收获的中性粒细胞重新悬浮在有或没有白色念珠菌的新鲜培养基中，并孵育4小时。根据Ding等人的描述，测量上清液中的亚硝酸盐水平[32]。简单地说，每个上清液50 μ L与等体积的Griess试剂(1%磺胺，0.1%二盐酸萘二胺，2.5% H3PO4)在室温下孵育10 min。以含0.2-0.3 μ M NO-2的无细胞培养基为空白，测定550 nm处的吸光度。用亚硝酸钠标准曲线测定亚硝酸盐浓度。

为了测定细胞因子的产生，将采集的中性粒细胞重新悬浮在有或不含白色念珠菌的新鲜培养基中，孵育4小时。根据制造商的说明，使用ELISA对上清液中的细胞因子进行定量。简单地说，ELISA板(Immuno Maxisorp;Nunc®，NJ)包被小鼠抗大鼠单克隆抗体(抗tnf - α IgG1克隆# 45418和抗cnc -2 IgG2b克隆# 123802)或多克隆抗体(抗il -1 β;研发系统，明尼阿波利斯，MN)，并在室温下孵育过夜。室温阻断1小时后，加入相应的样品和标准品孵育2小时。然后加入生物素化的二抗孵育2小时，然后与过氧化物酶结合的链亲和素孵育20分钟。用TMB在暗处显色20分钟。用2N硫酸停止反应，用酶标仪(Spectra Max 190, Molecular Devices)在465和590 nm处测量吸光度。细胞因子浓度测定采用重组小鼠细胞因子(R&D Systems)制备的标准曲线，检测灵敏度为4 ~ 10 pg/mL。

将白色念珠菌(ATCC-9002-8)在10% Sabouraud’s葡萄糖培养液(圣保罗大学药物科学学院临床分析系微生物学和真菌学实验室)中30°C培养24 h。离心，用Dulbecco PBS洗涤2次，2 × 10重悬⁷/毫升。用亚甲基蓝0.05%(>98%)排斥测定细胞活力，在Neubauer氏室中计数。采用Sampaio等[33]和Lima等[21]的方法测定其吞噬和杀真菌活性。从共培养或对照单培养中收获的中性粒细胞(1 × 10)⁶细胞/ mL)与白色念珠菌(4 × 10)在37℃无菌塑料管中孵育(以避免细胞粘附)⁶真菌/mL)在RPMI 1640培养基中添加10% FCS。孵育40 min后，细胞离心将200 μ L的中性粒细胞酵母悬浮液粘附在玻璃罩上。盖片采用Wright’s染色和May-Giemsa染色，通过染料排斥试验评估被吞噬颗粒的细胞活力来确定其杀菌活性[27]。念珠菌中性粒细胞计数分别为0(未杀死念珠菌细胞)、1(1或2个细胞)、2(3或4个细胞)和3(>4个细胞)。候选菌活性指数采用Sampaio等人[33]所描述的每只动物的得分之和来计算。

所有组间差异的统计分析均采用GraphPad InStat软件3.01版本(GraphPad software Inc.， San Diego, CA, USA)，按照Glantz[34]进行。采用单向方差分析，然后进行Tukey检验，对比较单一栽培组和共栽培组的试验值进行多重比较(所有对组)。对其他试验的数据进行分析时，采用ANOVA和Bonferroni检验对单一对照进行多组比较，采用unpaired Student’s t检验对两组进行比较。P值<0.05认为有统计学意义。结果以平均值±标准误差表示。

为了确定CTX对ROS产生的影响，用毒素处理中性粒细胞和巨噬细胞单培养物和共培养物₂O₂测量了水平。中性粒细胞与LPS和ctx刺激的巨噬细胞(中性φ:Macr φ接触)共同培养或与巨噬细胞收集的条件培养基(中性φ:CM-Macr φ接触)共同培养均显示H水平升高₂O₂与未处理巨噬细胞共培养的中性粒细胞相比(图2A和2B)。而CTX则使H₂O₂在巨噬细胞中产生(图2C)，它不刺激H₂O₂在相同条件下，嗜中性粒细胞单一培养的产量(图2D)，从而证实了我们之前的数据[21]。

中性粒细胞与LPS和CTX共培养刺激巨噬细胞，显示基础HOCl产量显著增加(38%)，PMA刺激后也显著增加(76%)(图3A)。在LPS和CTX刺激的巨噬细胞的CM培养的中性粒细胞中也观察到类似的效果(图3B)。然而，单独使用CTX并不会刺激中性粒细胞产生HOCl(图3C)。

中性粒细胞与LPS和CTX共培养处理的巨噬细胞或CM刺激的巨噬细胞分别增加了52%和42%的ATP产生(图4)。毒素处理的巨噬细胞显著增加了91%的ATP产生，而单独CTX不影响中性粒细胞的ATP产生(图4)。

与未处理CTX的共培养相比，LPS和CTX刺激的巨噬细胞或CM共培养的中性粒细胞的杀真菌能力分别提高了30%和42%。然而，CTX并没有增强单核嗜中性粒细胞的杀真菌活性(图5)。为了确定CTX诱导的更高的杀真菌作用的潜在机制，我们在与白色念珠菌孵育4小时后，评估了适当培养的中性粒细胞的细胞因子分泌和NO的产生。

中性粒细胞与受刺激的巨噬细胞或CM共培养分别增加了103%和101%的NO产量，而CTX处理的中性粒细胞单培养在真菌暴露4小时后没有显示任何NO产量变化(图6A)。有趣的是，在CTX和LPS刺激的CMMacr φ中孵育24小时后，中性粒细胞分泌的细胞因子谱没有变化(数据未显示)。然而，由于细胞因子在抗菌防御过程中中性粒细胞-巨噬细胞相互作用开始时被调节(Ref)，我们确定了中性粒细胞和巨噬细胞之间较短的共培养时间是否会导致白色念珠菌吞噬过程中不同的细胞因子分泌谱。中性粒细胞与受刺激的巨噬细胞共培养4小时，IL-1 β和cinc2水平没有变化(图6B和6C)，但与未受刺激的巨噬细胞共培养的中性粒细胞相比，在候选细胞死亡期间分泌的TNF- α水平高出4.25%(图6D)。

基于巨噬细胞和中性粒细胞之间的功能互补性，以及CTX对这些细胞代谢的不同作用，我们评估了CTX处理巨噬细胞对中性粒细胞ROS生成和杀真菌活性的调节作用。我们的研究结果表明，炎症中性粒细胞与LPS和CTX共培养刺激巨噬细胞，或与这些巨噬细胞的上清液一起培养，增加了代谢和杀真菌能力。此外，CTX还增强了lps刺激的巨噬细胞的代谢。我们的数据与Faiad等人[35]的研究结果一致，他们证明CTX增加了来自荷瘤大鼠腹腔的常驻和肿瘤巨噬细胞中ROS和RNS的产生。因此，我们证明了CTX对巨噬细胞代谢的刺激作用与所涉及的刺激无关。

一些研究表明，LPS激活M1巨噬细胞对损伤做出反应[36]，其特征是增加活性氧和活性氮的产生和释放，这些化合物可以增强中性粒细胞的分泌能力[37-39]。事实上，中性粒细胞与lps刺激的巨噬细胞共培养增加了后者的炎症活性。本课组在前期研究中证实CTX不能直接调节中性粒细胞代谢[21]。然而，CTX诱导巨噬细胞的特殊代谢状态能够改变中性粒细胞代谢，刺激这些细胞产生更多的ROS和ATP，而后者反过来又增加了多种炎症介质的产生，如超氧阴离子、过氧化氢、一氧化氮和细胞因子等[40-42]。因此，ATP的增加是中性粒细胞代谢和活性的重要参数。我们的研究首次证明了CTX在巨噬细胞以及与受刺激的巨噬细胞共培养的中性粒细胞中诱导ATP产生的能力，而不影响两者的生存能力。这与Faiad等人[20]的研究一致，他们证明了CTX对大鼠腹膜巨噬细胞葡萄糖和谷氨酰胺氧化的刺激作用，导致ATP的产生增加[43]。这两项研究的结果都加强了CTX对巨噬细胞代谢的刺激能力，以及ATP在巨噬细胞相互作用中对中性粒细胞活化的重要性。目前，我们小组正在研究CTX介导的巨噬细胞和中性粒细胞活化的机制。

中性粒细胞的激活最终导致NO和促炎细胞因子如IL-1 β、IL- 8和TNF- α的产生，这进一步放大了中性粒细胞和巨噬细胞在抗感染炎症反应中的相互作用[1,44]。中性粒细胞的杀真菌活性可能涉及更受调节的细胞因子反应。例如，在白色念珠菌感染后，TNF- α迅速产生[45]，已知其通过增加巨噬细胞和中性粒细胞的吞噬能力和ROS和RNS的产生来激活巨噬细胞和中性粒细胞，从而消除入侵的病原体[46]。因此，我们评估了ctx处理巨噬细胞上清液培养的中性粒细胞产生的细胞因子和NO，作为其杀真菌活性的衡量标准。中性粒细胞中TNF- α水平显著升高，这与先前的数据一致，表明该细胞因子出现在抗感染炎症反应中中性粒细胞-巨噬细胞相互作用的早期阶段[47]。有趣的是，共培养的中性粒细胞在杀真菌阶段的NO产量显著增加。因此，我们假设TNF- α产量的增加可能促进了NO产量的增加，而NO产量的增加反过来又增强了中性粒细胞的杀菌能力。过氧亚硝酸盐(ONOO-)是NO与O2自发融合的产物，是各种病理生理条件下最重要的氧化剂之一，在ctx处理的巨噬细胞共培养过程中，也可以在中性粒细胞中产生，从而增强了杀真菌能力[48-51]。

我们的研究小组最近也证明，ctx治疗在感染利什曼原虫的巨噬细胞中诱导M1谱，ROS、NO、IL-6和TNF- α的产生增加，但不丧失生存能力[14]，这与皮肤利什曼病治疗的预后较好有关。脂质(LXA)及其脂质衍生物是巨噬细胞杀灭微生物活性的有效刺激物，并增加细胞内ROS水平[52-56]。最近对体外和体内模型的研究表明，CTX对LXA的产生有刺激作用₄及其稳定模拟物15-Epi-LXA₄，以及常驻巨噬细胞或肿瘤微环境的一部分ROS和RNS产生的增加[13,25,57]。因此，我们假设ctx处理的巨噬细胞分泌的这些介质，无论其激活状态如何，都可能增强共培养中性粒细胞的杀真菌能力。实际上是LXA的分泌₄和15-Epi-LXA₄和抗炎介质，如溶解蛋白和保护蛋白，在感染性微环境中由巨噬细胞通过抑制中性粒细胞募集来调节炎症反应[58,59]。因此，如果我们考虑到CTX刺激促炎和抗炎介质的能力，那么CTX处理的巨噬细胞激活中性粒细胞可能会增加杀真菌反应，而不会加剧局部炎症。事实上，CTX的调节能力可归因于其对不同炎症介质的多效性作用[13]。

我们的研究首次证明，在ctx处理的巨噬细胞中，ROS生成和中性粒细胞杀真菌活性的增加与氧化代谢的增加有关。lps刺激的巨噬细胞在接触早期诱导中性粒细胞产生ROS、ATP、RNS和TNF- α (H₂O₂从孵育1小时释放-补充材料图1)，并在较长时间内保持高水平(图7)。这可能与体内感染性炎症反应期间中性粒细胞的调节有关。

因此，本研究有助于了解CTX对炎症反应的调节作用，并再次强调该毒素在研究先天免疫中与中性粒细胞和巨噬细胞相互作用相关的炎症反应机制方面的潜力。

这项工作得到了2009/52330-9，巴西圣保罗研究基金会(FAPESP)和2008/57898- 0，国立Ciência毒素技术研究所(INCTTOX)和古根海姆基金会的资助;作者要感谢Andre Fonseca Alves先生在CTX纯化方面提供的宝贵技术援助。

利益冲突:作者声明不存在利益冲突。