Yeast是乙醇生产行业的主体寻找高效食盐耐用性以及使用酵母菌株对发酵行业很重要12酵母菌株即CDBT1-12从各种源码中分离并定性微粒菌株的分子特征排序D1D2区域26S RRNA基因12项中,10项被发现为Sacchaomycesecrevicee,1项为Wikeromyces反常所有的菌株都被发现 好乙醇生产者CDBT2被发现对高盐(15%)和乙醇(16%)富集度有耐受性CDBT7既耐盐度(达15%),又使用甘蔗和新树而不损乙醇生产效率CCDBT2乙醇生产效率因低电压应用而进一步提高在这种条件下,酒精脱水酶(ADH1)和回压脱箱酶(PDC1)在CDBT2中分别增加2.78+0.80+1.12+0.37+2.78+0.80+1.12++0.37观察新奇,以前未曾报告

Yeast,分子特征化,酒精去氢化斯,Pyruvate dearboxylase,外部电压

Yeast是乙醇生产行业的主体寻找高效食盐耐用性以及使用酵母菌株对发酵行业很重要12酵母菌株即CDBT1-12从各种源码中分离并定性微粒菌株的分子特征排序D1D2区域26S RRNA基因12项中,10项被发现为Sacchaomycesecrevicee,1项为Wikeromyces反常所有的菌株都被发现 好乙醇生产者CDBT2被发现对高盐(15%)和乙醇(16%)富集度有耐受性CDBT7既耐盐度(达15%),又使用甘蔗和新树而不损乙醇生产效率CCDBT2乙醇生产效率因低电压应用而进一步提高在这种条件下,酒精脱水酶(ADH1)和回压脱箱酶(PDC1)在CDBT2中分别增加2.78+0.80+1.12+0.37+2.78+0.80+1.12++0.37观察新奇,以前未曾报告

Yeast,分子特征化,酒精去氢化斯,Pyruvate dearboxylase,外部电压

寄生菌群是大多数养分丰富媒体/源的共同居住者,如水果、树皮、土壤等[1]组成重要类微生物 比细菌复杂酵母单细胞约8微米直径5微米倍增时间在最优生长条件下为1-3h[Morris等人,1992年]发布新闻报道说,全球酵母市场及其产品2017年接近76亿美元,并快速增长,预计到2022年将增长近107亿美元[2]烘培业最常用的酵母Sacharomycesevisie况且 多种类酵母 包括SCereviae用于制造秀优、微博和生产各种发酵产品,例如酶、维他命、顶部多机类物类、焦素类物类、多水性酒精类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类物类[3]鉴于上述酵母和酵母副产品的重要性,进行了广泛的研究,以查明、编目并保护世界范围的酵母菌株[4]

识别酵母过程包括序列分析受保护词组RNARNA18s和26sRNA基因编码广度分析,分析证明,不仅将它们确定为研究生物间进化关系有用的分子标记重要,而且对酵母的分子定性有用工具重要[5]与酵母特征描述及其分类有关的早期研究显示,pheno类型和geno类型之间存在广泛差异模式。为了清晰性并系统分类酵母,18S RRNA基因编码分析、18s RRNA内部转录空间仪和26s RRNA基因域1和2的脱氧核糖核酸序列(D1/D2)证明最优 [4-6]

已经做出许多努力从尼泊尔各种气候中分离和特征化并应用烘培技术,然而它们的分子特征描述和系统化评价都不足,尤其是在酿造方面。选择编织酵母的一个重要参数就是对盐和乙醇的耐受性,因为用于发酵的多沙英水解法通常含有高盐富集度,同盐一起生产乙醇将破坏文化稳定,因为它们对脂层造成损害[8,9]实验室长期以来不仅感兴趣分离和描述尼泊尔各种酵母菌株用于各种工业应用,还感兴趣评估其在外部应用电压下提高乙醇生产能力[10]并有兴趣隔离酵母,这些酵母使用葡萄糖和烟酒发酵,从填充子串中发酵,如lignocellosic生物量[11]本研究描述通过下列方式隔离和定性12个酵母菌株:(一) D1/D2域26sRNA基因;(二) 能力容留盐和乙醇并使用甘蔗和紫素作为高效乙醇生产子串;和(三) 电压供应对乙醇发酵中重要的两种重要酶表达方式的影响,即酒精脱氢素(ADH1)和eruvate decarbellase(PDC1)。

从尼泊尔加德满都山谷不同地区采集了各种样本并证实了酵母源(表1)。所有样本均在9月和10月采集,样本放入无菌拉链袋并存储于4oC直至进一步分析

酵母隔离度 :微粒从各种样本中分离出(表1),对微粒马尔塔斯Agar(YMA)介质产生感知作用(YOST提取量:3gmL^-1matt提取量3gm/L^-1Peptone5gmL^-1甘蔗:10gm/L^-1agar:1.5gm/L^-1和pH 4.5)或透税YeastMaltosebroth样本后再串行稀释并传播到YMA媒体上[12,13]孤立酵母聚居区分栽并存储于YMA斜坡和/或15%甘油储存

生物化学特征微粒分离隔离酵母研究效率,D甘蔗和D-xylose使用率,Glucose和xylose乙醇生产法,乙醇耐盐性estone提取养分媒体允许Yastone生长(PYN)(Peptone:3.5gm/L)^-1微粒提取量3gm/L^-1kH₂PO语言₄2gmL^-1MgSO₄:1gmL^-1并(NH)₄)₂SO₄1gm/L^-1并观察显微镜显示萌芽PYN媒体加2%甘蔗或Sylose用于判定生长和乙醇生产效率PYN介质补充1-22%盐(氯化钠)或乙醇用于盐和乙醇耐受测试[14]

glucose和xylose使用和乙醇生产研究隔离酵母均由PYN介质单独培养,并配有葡萄糖或色素作为碳水化合物源酵母生长通过Sherman描述的600纳米测量吸附度[15]并用Seo协议和关联方协议测量乙醇生产[16]10000xg离心机15分钟超值一毫升加到1毫升三丁基磷酸盐混合电流15分钟最后,转动混合离心机10000xg15分拆层约750微升上层转至另一管并混合等量酸化5%钾二色板试剂转动和离心过程重复下层集成使用光谱计测量595纳米

研究盐和乙醇容因酵母分离PYN介质分离所有孤立酵母菌株并配以0-22%氯化钠或乙醇并允许96h[14]生长pH4.5和温度28oC微量生长模式观察分光度变化(美国热科学)600纳米对中空[15]

从酵母提取脱氧核糖核酸全部脱氧核糖核酸使用脱氧核酸隔离箱提取出(Promega、Madison、WI、USA)。脱氧核糖核酸在空气中干15分钟并最后重新悬浮在40微LTris-HCL缓冲中(10mm/pH8)。基因组脱氧核糖核酸运行0.8%agarose凝胶电极剩余脱氧核糖核酸存储供PCR分析

D1D2区域放大26SRNA基因D1/D2区域通过PCR使用前向反向素数放大D1D2期望放大PCR碎片为680bPCR用25微值L反射量计算,内含:1mL(45ngg)基因组脱氧核糖核酸,1mL(25mM)MgCl2,12.5mlL2PCR放大试剂均从新英格兰生物实验室购买(波士顿、马州、美国州)。热循环条件为二分制初始减肥,后为三十五周期96分制45秒,五十二分制45秒,七十二分二分二分72摄氏度完成最后延时10分钟,存储温度4摄氏度PCR使用生物光电热回转器(Bio-Rad实验室,IrvineCA,USA)。

遗传分析:CDBT1-8的PCR产品在印度Ecelris实验室测序,Nova大学里斯本分校和CDBT9-12在印度Ahmadabad测序所获序列使用Bio-Edit软件编辑、编译和对齐序列相似性搜索使用GenBank爆炸协议植物进化树使用MEGA6软件相邻算法生成

应用电流对aDH1和PDC酵母菌株在电化学电池下按前文所描述的电流[1011]培养酵母菌株培养如上描述的PYN媒体ECCECC发酵文化没有外部电流源

RTPCR分析 mRNA级别判定ADH1和PDC1表达式

RNA孤立自酵母快速RNATMMiniPrep工具箱(Zymo研究,Irvine,Ca,USA)被用来隔离RNAyast样本(200ml)用600mlRNA解析缓冲区解析解析并离心清除细胞碎片清晰超标转入自转过滤器并装有采集管并离心机滤波回收混合等量乙醇(95-100%)和旋流混合体转入收集管和离心机中的Zymo-spinITCG列流水流被丢弃列先冲刷400mlRNA缓冲离心机两次洗刷700微升和400微升RNA冲刷缓冲区并离心机2分钟以完全确保清除冲刷缓冲区RNA通过离心法排出100微升自由水流出由RNA组成,该RNA立即用于准备CDNA供进一步研究

CDNA合成生物光线iScript^TMCDNA合成包用于编写cDNACDNA合成时使用的反应参数与制造商提供的协议一致整体反应混合为20微升,由5xiScript反转录入器(1微升)、Nuclease自来水(7微升)和RNA模板(8微升)组成。PCR循环条件如下:^欧市5分钟C反转转录入^欧市20分钟C反转录入激活^欧市C为1分钟)和握牌阶梯(4分^欧市C)级CDNA合成用0.8%agarose凝胶测试并存储到-20oC供进一步使用

ADH1、PDC1和TFC1基因表达式量化aDH1表达式水平由RTPCR量化相对量化技术用于比较基因表达式相对于参考基因TFC1(管家基因)被用作参考基因高级通用SYBER绿色超级混合染色所有组件使用前解析室温度试剂和组件离心收集管底部解析法,然后储存在冰上并防光反应混合中含15微L和SYBER绿色超级混合物(7.5微L)、前质素(0.35微L)、逆质素数(0.35微L)、核释放免H2O(5.8微L)和cDNA模板(1.0微L)。所有实验都用三重法优化结果RTPCR使用素数表2显示

PCR循环条件包括95oC2分钟折叠化,后为95oC30秒34周期折叠化,64oC退步30秒并72oC扩展30秒熔化曲线得到监控,PCR运行完成后,获取的数据被保存进一步的计算按元同业描述人工完成

Ct=Ct样本-Ct参考

C_t级=C_t级C样本_t级(控制)

所有图和统计分析均使用图表8.0.1此处报告值平均++标准偏差三次独立实验

词元分离和分子特征研究八大子串测试(表1)中,12个不同的酵母聚居点(CDBT1至CDBT12)分离(表3)。孤立的酵母为白化或奶油聚居地,一致性和纹理不一,Cletus和关联者描述为[20]所有隔离物有棉状或橡皮像外观(图1表3)。

生物化学特征变形全酵母通过萌芽成倍并产乙醇(表4)。CDBT7和CDBT8除甘蔗外还被发现使用xyloseCDBT2、CDBT3、CDBT7和CDBT11被发现耐受高盐浓度(15%)。所有酵母菌株显示正常生长,乙醇含量达4%,但CDBT8除外,CCDBT8只能容留2%乙醇(图2)。CDBT2被发现正常生长几乎所有酵母菌株都被发现在介质中生长14%乙醇,但CDBT2除外,CCDBT2可在介质中阻抗高达16%乙醇总的来说,从生化特征分析看,CDBT2和CDBT7被认为是乙醇生产的强效菌株,因为它们高盐和乙醇耐受性,并可以从甘蔗和xylose生产乙醇

分子微粒特征描述26S词组D1/D2段分析:680b放大26SRDNA产品经1.0%agarose凝胶电光确认顺序由BioEdit软件编辑并分析NCBI爆破[21]十二项元中,十项为Sacharomyceseblisie和CDBT7和CDBT8分别为Wikeromyces反常和Ceblindnerafabii(表3)。开发了植物化树,用MEGA6软件观察酵母间关联性(图4)。26SRDNA微粒CDBT2和CDBT7分别获得基因库加入号MK910215和MK910216[10]

此前,我们已经证明CDBT2培养品中乙醇生产增强,电流应用水平低[10]提高乙醇水平的理由可能是夸大关键酒精发酵基因表达方式,即ADH1和PDC1正因如此,全RNA从CDBT2菌株分离开来,在正常条件下培养,电化电池2V使用电流[Joshi等人2019]CDNA编译自孤立RNARNA和CDNA都确认 运行1%agarose凝胶实时qPCR用于量化正常电化增强酵母中“PDC1和ADH1”相对表达式

Gene表达式分析取量相同模板参考/内务基因TFC1测试PDC1和ADH1PDC1和ADH1相对表达法计算后比较TFC1基因表示法为参考基因CDBT2在正常生长条件下培养的基因表达法被用作控件,DCDBT2在电流下应用电化细胞中培养2V测试样本表5中获取的Ct数据清晰显示两种基因比正常状态高表达度获取的Ct数据使用元等协议计算ADH1和PDC1基因相对表达ADH1和PDC1基因表示2.78+0.80和1.12++0.37PDC1过分表达虽然较低,但总比我们所有实验的控制高反之,ADH1总是一贯和显著地表达过大(表5)。

12个酵母分离器中发现多为S爬虫菌株早就知道多线程Cereviae与酒发酵相关,并显示多态性[22]s多态Cereviae与小数特征[23]无关单片使用甘蔗作为发酵基子并发CDBT7异常值和CDBT8fabianii使用xylose基调发酵W.与甜菜厚果汁隔离的异常菌株被发现具有相似乙醇产量,但需要较长发酵时间并可用xylose[24]反之,CDBT2菌株被发现是乙醇生产的一种强效酵母菌株,使用葡萄糖为基质,耐高盐和乙醇富集性尤斯特菌株CDBT7不单容忍高盐和乙醇浓度并同时使用甘蔗和色素生产乙醇,源源丰富,如Ignocellosic生物水解[11].选择盐和乙醇耐用菌株时必须使用酵母菌株使用中值介质优化生产乙醇乙醇发酵期间对酵母细胞造成压力的各种条件中包括乙醇毒性、不良环境因素、悬浮休克和盐压[26]酵母无法适应这些压力条件导致慢或不完全酒精发酵[27]Sutticha公司和关联者表示,乙醇耐受度高达5%被认为是乙醇生产[28]的良好隔离多数隔离SCereviae报告可保住46%,含5%乙醇可保住48h本观察与文献报告[14]一致在这方面,CDBT2可成为工业乙醇生产的良好菌株,因为它正常生长达6%乙醇此处描述的其他污点显示增长显著下降4%这些结果与Chiranjevi和关联者报告结果相似[29]Gonzalez和关联者表示,乙醇耐受度因媒体组成和文化条件[30]而略有变化

低应用电场2V电解槽中ADH1和PDC2导出表达法新奇,并正在进一步评价该观察法,以通过实验室各种酵母菌株、真菌和细菌提高乙醇生产TFC1内管基因被使用为参考基因比较ADH1和PDC1基因的诱导表达TFC1是RNA聚合物数三分数复合TFIT调控内务基因表达方式是一个基本因素TFC1基因定位于染色体二类PDC1是TePDC1是酒精发酵中关键酶 解箱状物回火PDC1还参与氨基酸催化酵母基因组中PDC1定位于染色体十二类232390-234081PDC1同时处理氨基酸和ag-keto酸,可起管家基因作用,表达素位常高这可能是本研究电流应用下高表达度低的原因必须指出,在我们迄今进行的所有实验中,PDC1水平虽然低,但均比控件高aDH1是四分之一中将乙醇减为乙醇(乙醇发酵率确定阶梯)所需的主异子元数(ADH1、2、3和5)。ADH1基因定位于酵母染色体第十五组(159548--160594)。ADH5参数ADH1ADH1显性高表达意义,因为酶不仅催化速率确定步数,还涉及氧化解毒反应althydes引起氧化性压力并归为酒精通常被视为解毒过程在这次研究中,我们清楚地显示S语中PDC1和ADH1 mRNA的超表达式CereviaeCDBT2菌株培养此前,我们还报告DCDBT2酵母菌株应用电场下乙醇产量增加[10]PDC1和ADH1应用电流表示法ADH1和PDC1表达式提高酵母乙醇产量和细菌[3132].

作者感谢中心生物技术系Tribhuvan大学提供实验空间和工具设施由衷感谢Dr.Paula Gunclaves,east基因实验室,葡萄牙里斯本Nova大学测序PCR产品和宝贵建议

本条不包含由任何作者对人或动物进行的任何研究

所有作者均无利益冲突