后台 :是一种特殊形式 多类真菌和细胞墙厚化合理操纵clerotium将是一种创新方法,用于病原体控制以及药用真菌资源恢复Polyporusumbellatus用Sclerotia治疗多重人类疾病增稠细胞墙机制尚不清楚

方法论在这次研究中,从顺序式窗口获取所有理论分片光谱和并行响应监控技术,以展示从初始ecrotia到开发成熟scrotia(DS和MS)等与TCW关联的蛋白层次生物标志

结果:72微分表达式蛋白与TCW相关联,并有证据支持p细胞墙中citin、glycan、xycan和hyphobumbellatusclerotiapump122Pumbellatus用DS/IS119.85和MS/IS128.17高清晰表达,并用免疫共聚金技术定位于单片墙和sepumhypha此外,单片细胞墙可通过O-mannosylation、O-focylation和deacie结论:本研究为真菌细胞墙提供新洞察力,特别是clerotia成型真菌

多波鲁斯Umbellatus,S,细胞墙,细胞墙加固,细胞墙重构

后台 :是一种特殊形式 多类真菌和细胞墙厚化合理操纵clerotium将是一种创新方法,用于病原体控制以及药用真菌资源恢复Polyporusumbellatus用Sclerotia治疗多重人类疾病增稠细胞墙机制尚不清楚

方法论在这次研究中,从顺序式窗口获取所有理论分片光谱和并行响应监控技术,以展示从初始ecrotia到开发成熟scrotia(DS和MS)等与TCW关联的蛋白层次生物标志

结果:72微分表达式蛋白与TCW相关联,并有证据支持p细胞墙中citin、glycan、xycan和hyphobumbellatusclerotiapump122Pumbellatus用DS/IS119.85和MS/IS128.17高清晰表达,并用免疫共聚金技术定位于单片墙和sepumhypha此外,单片细胞墙可通过O-mannosylation、O-focylation和deacie结论:本研究为真菌细胞墙提供新洞察力,特别是clerotia成型真菌

多波鲁斯Umbellatus,S,细胞墙,细胞墙加固,细胞墙重构

多波鲁斯Unbellatos(中国曲词)是中国传统药用真菌并产生良好的二分效果,历史超过2000年现代药理学显示Pumbellatus或它代谢物有nephro保护活动、hepato保护效果、增强免疫活动、反氧化活动和反点火[1]Ergosta4、6、8(14)、22-Teraen-3-oneumbellatus已被证明防止肾损伤和随后肾纤维化增[2],抑制Creatine、尿氮、尿蛋白和N-acyl-b-D-glucosamineP多功能注入TMumbellatus(Zhuling DplugZsheye)用于抗核素[3]P.umbellatus及其产品在亚洲仍然疯狂使用

实战医学部分umbellatus展示这些生物活性是一个名为screotia的专门结构,它不同于hypha[4]结构支持长期生存并复杂地连接到厚墙细胞诱导不良环境条件的结构变换[5-8]微薄细胞墙细节机制目前尚不为人知

野生性可生成并开发后用符号式真菌 Armillia melea曾位Amallea入侵Pumbellatus,screotia可以搭建像长城这样的带 停止进一步入侵mellea相似上皮组织sclerotia [5]显示细胞墙可接近某些蛋白质并可增强并重塑为ecrotia开发前情提要发现细胞墙蛋白质(高价和非高价细胞蛋白质)对细胞墙大有贡献,尽管芯片和果实体蛋白总数更高[9]高密度细胞墙umbellatusclerotia

蛋白质组学一直站在前列,作为丝状真菌和其他人类病原体和植物工具[10]基于顺序窗口获取所有理论碎片离子光谱-MS数据独立获取模型可提供差分表达式蛋白质[11]对目标蛋白质而言,并行反应监控-MS技术对每次转换用前缀离子全面扫描实现量化观察,并广泛应用到不依赖特定抗体的DEP验证上[1213]SWATH-MS加PRM将是一个获取生物标志的强效技术

初始ecrotia与hypha相区别后开发screotia在当前研究中,我们从蛋白质层次获取生物标志物,帮助变稠细胞墙塞罗提亚和它们如何辅助细胞墙加固和重塑Pumbellatus.理解细胞墙变稠机制有助于合理操纵clerotia开发,这将有利于药用真菌资源恢复,并有利于真菌病原体控制

P.umbellatus取自野性三联赛,并按前述方式培养[8]当前研究Pumbellatus用盘装软糖全介质在暗室温度下培养获取ecrotiaP.umbellatosclerotia后第30天、40天或90天收集并定义为初始cleotia(IS)、开发screotia(DS)和成熟screotia(MS),分别用于PRM验证、ELISA分析及酶活动解析

PRM分析的蛋白质和粒子制作前报告 [4]简言之,蛋白质取自clerotia, 并用冰冷acone二次净化并用0.2% RapiGestSFTM(Waters)溶解50mm二碳酸Peptides使用顺序修改试金化(enzyme对蛋白率约1:40)消化,最终蛋白浓度约1mg/m候选DEP使用并行响应监控法确认纳诺LC-MS/MS分析使用轨迹分解质谱仪进行,该质谱仪配有纳米喷射反射线Ion源码和UltiMate3000RSLCNEPepmapC-18RP内存列(3mm,100mx20m,bem-Fisher科学)中注入PepmapC-18内存流率6ul/minPeptides以流速300nl/m0摄氏0摄氏55摄氏分层梯度3-8-28-95%溶剂B(0.1%FA,80%ACN)超过120分钟电喷离

轨道反聚变以正离子模式操作,纳米喷电设为2.1kV和源温度定为275摄氏度工具以PRM模式操作MS检测解析功率为m/z200全宽半值m/z350-2000和MS扫描3万m/zm/z所有数据均按Xcalibur4.3操作软件获取

PRM数据使用Skyline处理(v.3.6)。peptide设置:酶设为trips in[KR/P],最大漏取数设为2脉冲长度定为8-25可变修改设置为Cys和xionationonMet最大变异修改数设置为3

过渡设置:先质收费设为2+3+4+离子电量设为1和2离子类型设置为by产品离子设置从离子3到最后离子不等,离子匹配容度设定为0.02Da

Laccase取自新鲜sclerotia并按lacase装箱指南(Solarbio生物科学公司)执行酶活动解析Ltd.)样本蛋白溶液中的40微L用作测试样本,而卷积相同的锅样蛋白溶液则设定为控件每种样本在60摄氏度插入水池3min接下去,200微升溶液置入96瓦板井中,测量摄取量为420纳米Enspire多模式阅读器上(PerkinElmer公司)Ltd.)采集3个生物样本,对每个生物样本测量2次光密度值减去控制管OD值作用为实际OD值Enzyme活动计算U/g

e-mannosidase或a-lfosese的富集度根据装箱指南(MSKBIO公司)使用ELISA测量标准曲线法Ltd使用梯度5pg/ml、10pg/ml、20pg/ml、40pg/ml或60pg/ml

大型程序如下:10微L样本溶液和40微L样本稀释溶液加到一井ELISA测试板上,并分层37摄氏度30分丢弃解析法并用200微L冲刷法洗井并加50微升酶标签试剂后加50微L开发者A和B溶液,轻轻混合,并开发于37摄氏度下加50ml停止求解以停止响应最后,所有样本OD值测量为450nmonenspire多模式阅读器无样本水井和酶标签试剂充斥空井

hyphobinpup122(hyphobinB类蛋白)初始ecrotiapumbellatus测试免疫色素金定位技术实验过程指前一则文章,一般步骤如下:Sclerotia切成小片直径约0.3cm,并固定为4%甲状腺素溶液(4摄氏度)和脱水梯度乙醇溶解法(4摄氏度)[8]脱水样本连续处理乙醇-LR白环氧树脂混合物(乙醇:LR白=3:1:1:1和1:3),并嵌入LR白树脂粒子切入50-80纳米超深段并三次用蒸馏水、PBS甘油溶液和PBS-T正确顺序冲刷切片隔夜4oC稀释反泵122反机解法(6000次)样本中贴有标签的蛋白通过JP-1230传输电子显微镜视觉化(日本东京)。

sWATH量化蛋白选择并规范化并用测试比较MS对s微分表达式蛋白IS/MS/sDS和DS对IS系统DEP联盟通过Venn图完成,Go注解和KEG路径浓缩分析由Omsce参与ecrotia防御结构的DEP被选择接受进一步分析以调查screotia形态变化计算结果显示为M+SD(n=3)跟踪Grubbs测试消除可疑数据

初始screotia(IS)、开发creotia(DS)和成熟creotia(MS)的ProteinsIS/MS/sDS和MS对IS[4]611合并DEPIS/MS/sDS和MS对IS分组(见补充材料1(S1))包括85种未知蛋白质(comp11158_c0、comp13970c0、comp142821c0等)和526识别蛋白质(Q49W60、O14241和Q1K9C2等)GeneOntology浓缩和KEG代谢浓缩这些合并DEP见2-3补充材料S2-S3

合并DEP生物信息结果证明开发Pclerotiaumbellatus特征为多机群合成和水解解解解解解解解解解解解解解解多机群解解解解解解解解解解解解解解解解解解解解解解解解解解解解解解解解解解解解解解解解解解解解解解解多机umbellatus细胞墙微数组变化可直接波及clerotia据报P单片类umbellatos包括xylose、glucese、mannose、galactose和fructese72DEP与单元墙组件相关联,合并DEP列表见补充材料4(S4)

72DEP可归为功能类别,包括碳水化新陈代谢、小GTPS介送信号转换、细胞内信号移植、有机物新陈代谢、代谢过程、细胞墙生物生成和其他生物过程碳水化合物代谢物(29)和单机碳水化合物代谢物(10)大增(图1A)。某些DEP函数类与反焦化、sucrose、olgoscharide、glucan、多沙化代谢过程相关联,这些过程还被发现在KEG碳水化新陈代谢和glycan生物合成代谢路径中丰富(AG)(补充材料5(S5))。偏差表达路径模式已知与真菌细胞墙的生成相关联,它由复杂多功能类集(如glucan, chitin等)和蛋白质组成[14]并发Pumbellatus证明生物合成多机组由单机组组成,如manose、gallactose、glucose和fructese[3]此外,细胞墙组织或生物生成生物过程得到丰富(图1A),显示单片墙同时合成为Pumbellatus开发成熟分子函数子类中,34DEP与流粒活动相关联,17DEP与流粒活动相关联,对(O-Glycosyl复合物(图1B)采取行动因此,我们建议细胞墙组织过程是一个连续过程,而细胞墙结构的水解修改遍历DEP生物函数和表达式列作补充材料4(S4)

72个DEP中的适当点选为PRM测试目标相同量的索引保留时间分量添加到每片样本中并校准保留时间最后,27个蛋白质和54个peptide可用PRM量化,包括11个iptide蛋白质、8个2ptide蛋白质、6个3ptide蛋白质、1个4ptide蛋白质和1个5petide蛋白质

前体离子m/z、变化、起始时间、端点和分片离子汇总并载入补充材料6(S6A)。量化peptides使用Skyline处理(v3.6)并计算面积、中值面积和量化蛋白标准偏差,并载入补充材料6(S6B)。表1显示IS、DS和MS计算量化蛋白相对表达度

IS、DS和MS中的 Al-Fucosidase或Di-manaseumbellatus用标准曲线y=0.0071x+0.0088计算²0.998 Alphosisey=0.0353x+0.1738²=0.964用于x为样本集中y为absorbance表2显示相位相位相位的富集度和相对比Alpha-fosidase表达式在整个增长中提高调控度(MS/DS/245、MS/IS2.63),并有与SWATH和PRM量化相同的趋势。e-mance下调sclerotia成熟ds/IS0.242和MS/DS0.806

P. Laccase活动umbellatusclerotia初始阶段、开发阶段或成熟阶段使用公式65#A/w计算总体说来,单片活动随着clerotia开发成熟而增加,在成熟阶段用MS/DS3.11实现最大值(表2)。

pump122指从P.umbellatos并类同hyphobinB[15],命名为hyphobinB类蛋白传输电子显微镜umbellatus交织并坚持使用,并集中使用clerotia开发部分hypha细胞墙大增,部分hypha合并成hypha中间的erucidaPump122定位于细胞墙和Hyphae和绑定连接二维图二A和B表示Pump122不单是细胞墙组件,而且还有助于ecrotia开发

scriotium从hypha启动,初始阶段从白聚类转换为僵硬休息结构显性细胞生成图2显示薄膜状细胞墙结果表明数种蛋白质可注入细胞墙新陈代谢使用蛋白质组分析发现细胞墙结构相关蛋白质,细胞墙增强并重发成clerotia开发成熟

细胞墙由chitin(chitosan)、glucan、GPI锚和细胞墙蛋白等组成Chitin组成细胞墙网并提供机械稳定性[16]并用 chitin生成二层结构 沿spore厚墙,邻接外部dityrosine层以响应环境压力[17,18]增加chitanse2和sedolisin-B显示citin代谢函数(表1)umbellatussclerotia成熟

Glycan是真菌细胞墙的一个主要组件glucan链通过添加Ba-13glucan链路中的甘蔗,并分解a-1-4glucan链路细胞墙不是静态结构,平衡水解和生物合成变长甘蓝链大响应,启动ecriotia差分表示+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++单片机成熟后,可激活流星体,特别是glucan13BetaglusiGlycoren(Starchglycan)和glucan分支在真菌中扮演重要角色Glycogen多片状多采甘蔗,可作为一种形式在真菌中存储能量glycorent的形成和退化均发生于a-1非下降端-4链式链式分治增加可用端数并因此提高glycogen分解或重合成率甘醇水平提高,多子类接触养分限制或其他严重条件时小分支[20,21]塞洛蒂亚umbellatus分支酶下调(表1中PRM验证),尽管glycority合成酶上调,显示glecority在clerotia稳定化,小分支glucan可促进clerotia适应环境压力液化甘油可释放葡萄糖,作为相位生长或细胞墙合成的养分并改制基本素材然而,我们不知道P.umbellatus.

细胞墙蛋白还增强细胞墙,包括二价细胞墙蛋白和非二价细胞墙蛋白共价细胞墙蛋白与细胞墙其他组件并发,非相价细胞墙蛋白则与细胞墙生物合成或代谢相关联(补充材料1(S1)。在这次研究中,三种共价细胞墙蛋白值得注意:PRM的hyphobin SC1、SC3和pump122基于GO注解结果, 我们推测hyphone代理代理辅助hyphaePump122免疫编程并定位于细胞墙和Hypha子宫二叉形图2显示它是细胞墙组件并关联到分片开发三大蛋白分解特别是Pump122ds/IS 119.85和MS/IS 128.17使用PRM验证越厚细胞墙,Pump122表达度越高(图2A)。结果表明,水相联量的增加不仅会增强hypha互连性,而且会增强细胞屏障clerotia

除单片细胞结构中的蛋白质外,一些蛋白质有助于修改单片或蛋白后翻译修改为Pumbellatusclerotia成熟蛋白质对O-mannosilation、O-focolation和deacislation负责,并增强细胞墙稳定性和完整性

O-mannosylation是一个关键和节制修改过程eukaryotes并应用各种函数,例如撞击细胞墙完整性、细胞极化和模组生成[22]O-mannosylation用dolichol-磷酸mannosylDolichol磷酸mannose转移mannose从GP-mannse转成dolichol单磷酸(dol-P-mane),Dollichol磷酸manose显示GPI锚定O-mannosilation提升, 帮助加强细胞墙的稳定性和完整性[24]反向下调P类O-mannoslation相关蛋白umbellatusclerotia成熟阶段表示曼南水解可能被抑制开发阶段未定性蛋白YMR196W(Q04336)和Bi-mannosidese人工算法是加强P单元墙的关键函数umbellatus.

O-fcollation是翻译后基本修改P.umbellatus、alpha-sylosidase(P31434)和apha-fusadeseA(A2R797)协同参与完全拆解xyloglucan骨架Alpha-xylosidase催化水解xyloglucan侧链清除附于glucose的非代用D-xylose残留物,而可能aphucosidasea增积组织中的二维线链体积减少可促进细胞墙松绑,淡化二维线链体与其他细胞墙组件关联性也较低,导致扩展性下降[26,27]IS和DS之间没有观察到与O相容关系有关的蛋白质趋势的重大差异(表2),而在成熟期间折叠变化剧增(表1和表2)。成熟期间表达式增加可能是由于成熟ecrerotia硬化而减少细胞墙的扩展性

据报解构在生物攻击和防御系统中起着重要作用,尤其是在真菌细胞墙的Chitin和Chitosan中[28]P.umbellatus,两种酶关联citin和chitosan新陈代谢Chitin合成并成线性同族聚合物,由N-acylglucasami残留物组成Chitin转换为chitosan由 chitindeatyrace和N-acylglusamine-6-磷酸deacetyrase催化,它们可水解N-acemido类N-acetyl-Dglucosam残余 [30]二次解剖表达式大为下降,因为clerotia开发并成熟化(由PRM验证如表1所示)表示Chitin是细胞墙核心构件,在初始阶段完成解剖失序会暴露GlcNAc残留物中的氨基聚积,并增强分层分布的citin同族聚合物中的氢联结(图3)。外溢 chitin更容易与Glucan、蛋白质和GPI锚等细胞墙构件并发并发,并有助于加强细胞墙稳定性

细胞墙厚化是真菌中常见的现象, 特别是在单片状生物中, 诸如药用真菌Polyporusumbellatus理解细胞墙增厚机制将有利于药用真菌资源恢复,并有利于真菌病原体合理控制72个蛋白质生物标志与增稠细胞墙相关联,通过量化蛋白分析并并行响应监控验证初始scretoia、开发ecretoia和成熟screotia证据支持Citin、Glycan、xycan和hyphobumbellatusclerotiaHyphobinB类蛋白puumbellatus用DS/IS119.85和MS/IS128.17高清晰表达,并定位在细胞墙和hypha塞普图此外,单片细胞墙可通过O-mannosylation、O-focylation和deacie发现新机制透漏细胞墙umbellatus,它可能也适用于其他真菌

BL和SXG构思并设计实验BL研究蛋白质组BL和LL为这项工作进行了生物信息分析YMX和LL帮助BLPRM量化SXG帮助进行目标蛋白细胞定位测试所有作者都批准了最终手稿

作者声明不竞合金融利益

此项研究得到中国自然科学基金会资助8773843,中国自然科学基金会青年方案81803666和中国医学创新基金