宫颈癌是女性中最常见的恶性肿瘤。现有的筛查方法Paptest和阴道镜容易出现假阳性/阴性结果。极低浓度的肿瘤标志物检测不仅可以提高肿瘤检测的敏感性和特异性，而且可以增强肿瘤预先检测的可行性。因此，我们使用了高效液相色谱结合激光诱导荧光(HPLCLIF)，可以在飞毫摩尔/亚飞毫摩尔水平上鉴定蛋白质。7例恶性肿瘤患者和4例对照组的组织匀浆在生理盐水中按每转30秒6次冲洗制备。采用主成分分析(PCA)作为多元统计工具。PCA是一种数据缩减技术，在这种技术中，大量的光谱数据被描述为称为“特征向量”的少量自变量，用于重建光谱的缩放常数被称为“分数”。因子评分是组织类型分类中广泛使用的参数。我们的发现表明，一阶导数色谱在1250-2700秒区域有5个因子的PCA可以区分正常和恶性色谱。

宫颈癌，组织匀浆，主成分分析，HPLC-LIF。

宫颈癌是女性中最常见的恶性肿瘤。现有的筛查方法Paptest和阴道镜容易出现假阳性/阴性结果。极低浓度的肿瘤标志物检测不仅可以提高肿瘤检测的敏感性和特异性，而且可以增强肿瘤预先检测的可行性。因此，我们使用了高效液相色谱结合激光诱导荧光(HPLCLIF)，可以在飞毫摩尔/亚飞毫摩尔水平上鉴定蛋白质。7例恶性肿瘤患者和4例对照组的组织匀浆在生理盐水中按每转30秒6次冲洗制备。采用主成分分析(PCA)作为多元统计工具。PCA是一种数据缩减技术，在这种技术中，大量的光谱数据被描述为称为“特征向量”的少量自变量，用于重建光谱的缩放常数被称为“分数”。因子评分是组织类型分类中广泛使用的参数。我们的发现表明，一阶导数色谱在1250-2700秒区域有5个因子的PCA可以区分正常和恶性色谱。

宫颈癌，组织匀浆，主成分分析，HPLC-LIF。

宫颈癌是一种潜在的可预防疾病;然而，它仍然是世界上最常见的妇科恶性肿瘤。虽然Paptest和Colposcopy是现有的筛查方法，但它们往往容易出现假阳性/阴性结果[2,3]。这可能是由于组织病理学的主观解释，需要熟练的人员。分子生物学和高通量技术的进步为发现新的生物学标志物用于宫颈癌[4]的筛查和早期诊断提供了希望。多项基于蛋白质组学的研究报道，属于含Gasdermin-domain-containing protein家族[7]的血清鳞状细胞癌抗原(SCC) CA125 [5,6] Gasdermin-like (GASDML)可作为宫颈癌筛查的生物标志物。研究还报道，HPV E6和E7癌蛋白可能有助于宫颈癌特异性标志物[5]的发展。然而，免疫分析一般只适用于检测单一标志物的时间和耗时。单次检测多个单独的标记可以提高早期发现的机会。

光学光谱方法拉曼[8,9]傅立叶变换红外(FTIR)[10,11]和激光诱导荧光[LIF][12-15]已被证明是癌症诊断的有前途的替代方法。在我们早期的研究中，我们已经证明了拉曼光谱诊断宫颈癌[9]的方法学。然而，这些方法可以提供蛋白质、脂质和DNA等光谱标记物的总体信息。作为下一种方法，已经尝试证实个体生物标记物鉴定的可行性，这些标记物在疾病状态下是多余的。为了实现这一目标，我们在实验室中开发了一种独特的装置，能够检测亚femtomole水平的蛋白质。该装置包括耦合激光诱导荧光(HPLC-LIF)的高效液相色谱。在我们早期的研究中，使用侵入性较低的血清样本和乳腺癌组织匀浆，证明了该技术在口腔[16,17]和宫颈癌[18-20]中的诊断潜力[21,22]。然而，与正常相比，恶性宫颈组织不仅表现出几种蛋白数量的显著增加，而且还会形成大量额外的蛋白。因此，我们探讨了色谱标记物在子宫癌识别中的实用性。

组织活检来自马尼帕尔市Shirdi Sai Baba癌症医院放射治疗和肿瘤科的8名FIGO IIIB期宫颈癌研究参与者(年龄35-67岁)。4个从常规子宫切除术中采集的无宫颈恶性肿瘤的组织样本作为对照。这些样本是在生理盐水中收集的;然后用液氮速冻，如果需要保存在-80℃。这些样品在实验前30分钟被动解冻至室温。

在我们的实验中，干燥的组织用生理盐水(10% w/v)切碎，并使用手动均质机(T8刀片IKA-WERKE)在冰浴中均质。在我们的试运行中，我们已经确定了蛋白质浓度为10%的盐水匀浆，6次，每转30秒，从组织中提取最大浓度的蛋白质是理想的。内容物在5000转/分下离心10分钟，收集上清。上清液再次离心5min以去除残留碎片的痕迹，然后在显微镜下检查。取20μl无碎屑清液注入高效液相色谱柱，采用室内HPLC- lif仪记录色谱图。

组织匀浆的标准化是样品预处理的关键环节。这一步骤主要是为了保证不同组织匀浆蛋白浓度的一致性，从而便于对不同种类的色谱图进行相关性分析。为了使样品均匀化，用分光光度法(双缩脲法)在450 nm处对总蛋白含量进行定量。

本研究采用反相高效液相色谱体系。这包括联苯窄孔柱通过PEEK油管连接到系统，用于分离蛋白质。分离出的蛋白质通过直径为75μm的石英毛细管洗脱。色谱条件为溶剂梯度为30 ~ 60%，流速为0.2ml/min。采用514.5 nm倍频BBO (β -钡硼酸盐)晶体获得腔内频率加倍的Ar+激光(257nm, 10 mW)，在340 nm处激发荧光。激光束紧紧地聚焦在毛细血管上。流出物中的蛋白质由于与激光束的相互作用而被激发并发出荧光。发射出的荧光通过收集光学进行准直和收集，然后聚焦到设置为340 nm的单色仪上。单色仪检测到的信号经光倍增管转换为电信号，再经前置放大器放大。信号在入口狭缝处以20Hz的频率被截断，用于锁定检测。 The chromatogram is recorded via lock-in chromatographic peak-detection arrangement which is interfaced to PC (Figure 1). Details and specifications of instrumentation were discussed elsewhere [16-18]. The fluorescence signal obtained from proteins is emitted as peak on the time axis (x-axis) and concentration of the protein is quantitated as intensity on y-axis.

色谱图在分析前经过预处理。通过拟合三阶多项式和衍生化来消除背景荧光的影响，对色谱图进行了背景校正。为了尽量减少/避免峰位在运行过程中的变化，色谱图通过沿时间尺度(x轴)移动到注入峰进行校准。注射峰在所有色谱图中都有出现，因此被认为是内标。在对感兴趣的区域进行插值后，色谱图使用Grams 32, PLS plus/IQ，银河工业公司，美国实现的算法进行主成分分析(PCA)。简而言之，PCA是一个因子模型，其中的因子是基于总结总方差。在PCA中，一致性被用在相关矩阵的对角线上，这意味着所有的方差都是共同的或共享的。算法缺乏底层模型。

公共因素分析:因素模型探讨了一个简化的相关矩阵。即在相关矩阵的对角线上插入共同性(r2)，提取的因子仅基于共同方差，排除特定方差和误差方差。探索数据的潜在“潜在”结构。模型假设可变性可划分为公共和唯一的组件:

特征值:也称为特征根。一个给定因子的特征值测量了由该因子所解释的所有变量的方差。特征值之比是因素与变量的解释重要性之比。如果一个因素具有较低的特征值，那么它对变量方差的解释贡献很小，并且可能被忽略为与更重要的因素冗余。特征值测量由每个因素造成的总样本的变异量。因子的特征值可以计算为所有变量的因子负荷的平方和。注意，与未旋转和旋转的解相关的特征值将不同，尽管它们的总数是相同的。

因子负荷:因子负荷，在主成分分析中也称为分量负荷，是变量(行)和因子(列)之间的相关系数。

在目前的研究中，PCA是在不同的条件下进行的:整个范围和选择的区域以及相同区域的导数使用不同数量的因子。显著性因子的数量可以通过特征值、总方差百分比和谱负载等技术来确定。在我们的试运行中，一阶导数谱在1250 - 2700秒区域与6个因素得到了最好的结果。以因子得分作为判别参数[16]。

图1描述了用于记录正常和恶性宫颈组织色谱图的HPLC-LIF装置。正常和恶性宫颈组织匀浆的典型色谱图见图2。从图中可以明显看出，主要差异体现在1250 - 2700秒区域。恶性色谱图以峰4宽肩为例。值得注意的是，恶性肿瘤中出现的8a峰在正常色谱中未见。此外，恶性图谱中双峰(9号峰)的幅度明显高于正常图谱。非常明显的是，与恶性色谱图相比，正常色谱图中10、12、16、17、18峰不存在/可以忽略不计(图2)。本研究未对恶性色谱图中过多的个别峰进行识别。这些色谱图转换成光谱，并用主成分分析(PCA)进行分析。图3展示了正常色谱图和恶性色谱图的无监督分析。因子1评分正常和恶性的均值和标准差分别为0.083+0.018和-0.041+0.369。 Mean and standard deviation values of score of factor 2 for normal and malignant were 0.0751+0.021 and -0.037+0.37.

近年来，人们对开发利用光谱学进行快速准确诊断的技术越来越感兴趣。尽管各种形式的光谱学已被证明是各种癌症非侵入性诊断的重要组成部分，但LIF与HPLC系统的耦合似乎具有挑战性。它将在早期阶段诊断癌症的前景推向了最前沿，但也可以在非常低的浓度下进行检测，这最终可以帮助我们加强患者的治疗计划，从而避免他们额外的发病率和成本。

鉴于此，我们采用反相高效液相色谱(HPLC)结合LIF检测蛋白的飞摩尔浓度，验证了区分正常和恶性组织匀浆的可行性。这不仅提高了癌症检测的敏感性和特异性，而且提高了在极低浓度蛋白质下检测肿瘤的可行性。与拉曼和LIF相比，这种方法的主要优点是随着疾病进展的高效液相色谱-蛋白质谱变化，以及在亚飞摩尔水平(或更低数量)蛋白质流经探测激光束时，在疾病进展过程中发生的蛋白质分解的识别。控制高效液相色谱法可使灵敏度提高几个数量级。任何一类物质(比如蛋白质)的拉曼光谱都是相似的;因此，很难确定蛋白质分解过程中发生的变化。

然而，文献中使用该系统利用血清样本诊断口腔癌[16,17]和宫颈癌[18-20]的研究很少。该技术用于组织匀浆诊断乳腺癌的研究也有报道[21,22]。据我们所知，目前还没有尝试使用组织匀浆来验证该技术在宫颈癌中的诊断能力。因此，在本研究中，我们尝试使用组织匀浆来验证宫颈癌的诊断能力。

在我们的初步研究中，样本的色谱图显示了一些重要的差异(图2)。与正常相比，恶性肿瘤中可以观察到峰4的宽肩。恶性肿瘤中双峰(9号峰)的增加可能在一定程度上表明该蛋白在定量上的冗余。正常情况下8a、10、12、16、17、18峰缺失或可忽略，可作为癌发生过程中的生物标志物。然而，还没有人尝试去鉴别那些在色谱图中表示为峰的蛋白质。因此，本研究确定的峰数仅仅是比较正常和恶性病变的典型色谱模式[23,24]。

众所周知，光学方法适用于几种多元统计工具，如层次聚类分析(HCA)，人工神经网络(ANN)， k-均值最近邻(KNN)最大表示和判别特征(MRDF)，可用于数据挖掘的主成分分析(PCA)。然而，如前所述，我们在第二种方法中选择了PCA作为判别工具。如前所述，PCA是一种著名的降维技术，它将大量的光谱数据缩减为少量的独立变量，称为因子或主成分，这些因子的贡献称为分数。以因子得分作为判别参数[25]。如“数据分析”部分所述，分析是在全区域、选定区域和相同的衍生物中进行的。如前所述，衍生化更有利，因为背景是自动校正的。色谱运行的背景可能来自于毛细管壁散射的激光、有机改性剂(乙腈)在梯度中的荧光、PMT暗计数等。由于背景荧光，色谱图有轻微的倾斜。在这种情况下，用三阶多项式进行基线校正可能会产生伪影。因此，我们选择了衍生化色谱(广泛应用于FTIR光谱)，以尽量减少基线/背景诱导的伪影。

正如在“数据分析”部分中提到的，我们的分析PCA为1^圣在1250- 2700秒区间，5个因子的导数谱得到了最好的结果，并在此条件下进行了进一步的分析。PCA是一种数据缩减技术，大量的光谱数据被描述为少量的自变量，称为“特征向量”或“因子”或“主成分”，用于重建光谱的缩放常数被称为“分数”。因子评分是组织类型分类中广泛使用的参数。结果表明，导数色谱的主成分分析具有较好的鉴别效果。正常和恶性色谱图的无监督分析产生了两种不同的簇，对应于正常和恶性组织类型(图3)。这些结果与早期使用血清样本的研究一致[18,19]。恶性组因子1、因子2得分均值较正常组有上升趋势。在恶性情况下出现更多的峰可能意味着在癌变过程中蛋白质的冗余。恶性情况下峰值9的大小表明蛋白数量较正常情况下增加。这项研究需要继续招募更大的样本量以及其他病理条件，随后获得每个条件的校准集。

与正常色谱图不同，恶性肿瘤中出现额外的峰表明不同蛋白质的增加。使用该技术可以清楚地区分正常和恶性情况。恶性肿瘤的额外峰值可能提示在宫颈癌发生过程中蛋白质的冗余。这些蛋白质的鉴定可能导致新的肿瘤生物标志物在宫颈恶性肿瘤。该技术的有效性有待大规模试验验证。未来将开发正常和不同病理条件下的模型。

这项工作是在原子能司资助的题为“激光光谱学作为宫颈癌放疗肿瘤反应的预测器”的项目下进行的;核科学研究委员会，印度政府第2003/34/17/BRNS/1903号。作者感谢Chetan Anand先生的技术支持。原子和分子物理中心(CAMP)主任C. Santosh博士也获得了表彰。作者之一(MK)感谢DAE-BRNS的研究奖学金。