meloma细胞通过小细胞囊释放DEL-1

对应细节

名称 :Peter Petzelbauer

电话:+4314040073786

国名 :奥地利

标识 :奥地利维也纳医科大学德马特科

链表作者Peter Petzelbauer、Marianne Schnödl、Felix Tuchmann、Judith Wenzina、Karin Neumüller高兰米图洛维玛莉安葛格格温海勒

Pdf 引用

杂志名 :国际癌症治疗杂志

文章类型 :研究文章

接收日期 :2022年6月06日
接受日期:2022年6月28日
发布日期:2022年7月5日

引用:Petzelbauer P公司、Schnödl M公司、Tuchmann F公司、Wenzina J公司、NeumüllerK公司等隐形细胞通过小细胞囊释放DEL-1IntJ癌症处理卷5,Issu2

版权使用量 :2022PetzelbauerPetal允许媒体不受限制使用、分发和复制, 前提是原创作者和源

抽象性

DEL-1(开发内分位器-1)诱导异狄氏信号并识别受非potice显示DEL-1被认为是隐式分子,无法检测黑素细胞培养超导体,但导出时使用异同路径并释放出小细胞外囊DEL-1阳性SEV的蛋白质组学,但DEL-1负性SEV不包含与癌症生存不良相联的蛋白质确定DEL-1是否适合预测处理响应,我们在用检查站抑制器处理90天前和90天从黑素病人等离子分离SEV即使在累进病患者中(很可能是由于从1ml等离子体分离的SEV极低蛋白分量),我们也无法检测血浆SEV中DEL-1,但主构分析允许对控件和病人以及处理前后病人有清晰的区别。有趣的是,在一个完全回归的病人中,后处理样本中,蛋白质表达剖面保留在预处理集群中sEV低蛋白分量和低患者数是本研究的明显限制,但结果显示这种方法有可能预测处理响应

关键字 :美兰玛小细胞外微博学Exsoces-DEL-1-EDIL3-Proteomics

缩略语 :DEL-1(开发内分层轨迹-1)EEA1(早期内分泌抗原1)sEV小队RGD(ArgGly-Asp)

抽象性

DEL-1(开发内分位器-1)诱导异狄氏信号并识别受非potice显示DEL-1被认为是隐式分子,无法检测黑素细胞培养超导体,但导出时使用异同路径并释放出小细胞外囊DEL-1阳性SEV的蛋白质组学,但DEL-1负性SEV不包含与癌症生存不良相联的蛋白质确定DEL-1是否适合预测处理响应,我们在用检查站抑制器处理90天前和90天从黑素病人等离子分离SEV即使在累进病患者中(很可能是由于从1ml等离子体分离的SEV极低蛋白分量),我们也无法检测血浆SEV中DEL-1,但主构分析允许对控件和病人以及处理前后病人有清晰的区别。有趣的是,在一个完全回归的病人中,后处理样本中,蛋白质表达剖面保留在预处理集群中sEV低蛋白分量和低患者数是本研究的明显限制,但结果显示这种方法有可能预测处理响应

关键字 :美兰玛小细胞外微博学Exsoces-DEL-1-EDIL3-Proteomics

缩略语 :DEL-1(开发内分层轨迹-1)EEA1(早期内分泌抗原1)sEV小队RGD(ArgGly-Asp)

导 言

DEL-1开发内分位-1, 并称EDIL3, 由多类细胞隐蔽诱发整数信号并绑定正数数数组并识别暴露于potice函数DEL-1取决于表达网站并干扰 myeropoiesis,它减少lekucyte招聘,促进efferocisi癌症DEL-1提倡上皮网膜变换,并独立预测乳癌和肺癌患者总体生存系数[4-6]与等离子分离的小细胞囊检测DEL-1已被确定为早期乳腺癌检测生物标志[7]黑素细胞DEL-1表示入侵行为,黑素样本高mRNA表示法与病人生存不良相关[8]反炎函数DEL-1使解释DEL-1对癌症作用复杂化,如鼠标模型所示。嵌入B16F10黑素细胞的小鼠DEL-1缺陷偏向黑素肺移位,原因包括减少中子积聚、IL-17A调控并减少NK细胞渗透[9]这项研究分析宿主源DEL-1效果,而非黑素源DEL-1效果我们问DEL-1mRNA表态是否与蛋白质生成相关,DEL-1是否以及如何发布并发问是否可以用此预测黑素患者的治疗响应

材料方法

细胞文化

VM-8、VM-14、VM-15、VM-21、VM-28、VM-47、VM-48和MCM1-DLN等由病人生成的细胞线前曾描述过[8、10-13]VM-15、VM-21和MCM1-DLN细胞生长于RPMI1640中型VM-8、VM-14、VM-28、VM-47和VM48细胞中HEK293T细胞由维也纳医科大学Martin Bilban提供人体静脉内延细胞(HUVEC)隔离使用前文所描述的,根据维也纳医科大学道德委员会允许EK 1621/2020[14]电池维护在37摄氏度,潮湿空气中含5%CO2并定期测试 Mycoplasma污染

单细胞囊

melanoma细胞生长至70%宽度,清洗后培养四天无FCS介质细胞培养介质在400xg采集离心机5分钟分解分解非适应性细胞,随后在1500xg清除剩余细胞碎片时对超生机离心10分钟分解获取的超生化管收集并转至超离心管(PCOak岭离心管25x94m)(ThemFishsScience,Waltham,MA,USA)。样本使用SorvallWX超离心机和T-1250转子机(都来自TermFish科学公司、Waltham公司、MA公司、USA公司)离心机120分100 000xg转粒子使用差分超离心协议拆分外片分量超导体首次离心机30分钟 方位18000xg分离Exosomes 剩余超生机转置到新鲜超离心机管并离心机120分100 000xgPBS重新悬浮并存储到-80°C供后续分析以内容为基础的EV特征据协商一致文件显示,二步离散协议黑素细胞衍生SEV含有EV特征所需的大多数类别1蛋白质(CD63、CD81、CD82、CD47、MHCI类LAMP1/2、SDC*EMMPRIN、ADAM10、NT5E、CD55、CD59、TSPAN8、CD37、CD53、CD9、CD90和大多数2类蛋白质*PDCD6IP、VPSA/B、ARRDC1、FLO1/2、EHD*、RHOA、ANXA*[15].HSP90AB1、ARF6、SDCBP)共分非EV蛋白与其他细胞内部隔块相关联的先质有LMNA、CANX、HSPA5、ATG9A、ACTN1/4、KRT18

人类等离子体分离得到维也纳医科大学医疗道德委员会批准(ECS 1780/2018),并符合世界医学协会国际医学道德守则(赫尔辛基宣言)。EDTA编织管收集血液,5名健康自愿者(3名男性和2名女性平均34.+15岁)和黑语患者经知情同意前(0日)和后(90日)免疫法处理详细病人数据可见表1Plasma离散达1500xg10分钟,复制并存储在-80摄氏度或液氮离散Exosomes中1ml等离子稀释PBS并离心机1500xg15分钟耗尽板块获取超生机收集并转至超离心机管并离心机30分钟18000xg清除微粒,接后120分100 000xg切除粒子ExsocesPBS解析并存储到-80摄氏度以内容为基础的EV特征据共识文件显示,二步离散协议后从等离子体EVs含有EV特征所需的某些类别1蛋白质(ADM10、CD59、CD9、GYPA)和不包含二类2蛋白质[15]共分非EV蛋白类为APOA1/2和ALB没有其他细胞内隔块相关蛋白质可检测值得注意的是,等离子样本的低蛋白产量肯定限制本项研究,然而,由于缺乏污染蛋白支持相对纯度隔离

抗体和试剂

本研究使用的主要抗体包括:反EDIL3(SC-293337)(Santa Cruz,Dallas,TX,USA)和反EEA1(#2411)(ell信号技术,Danvers,MA,USA)。二次抗体西布洛特分析为IRDYE800CW(925-32213)和IRDYE680RD(925-68072)(均来自LI-COR生物科学公司LincolnNE二级抗体免疫用自TermoFish科学公司(Waltham,MA,USA)的山羊反rabbitIgG-Alexa546

imunoblotting

西布洛特分析用RIPA缓冲区(50mMTris、150mNACl、1%NP-40、0.5%dorodexcholate、0.1%SDS)隔离整片细胞和全部极解析物,并配有1%原生抑制器和磷酸抑制器2和3Louis,MO,USA)样本在14000rpm4摄氏20分超导素内容使用BradfordProteinAssay测量细胞液化物共30微g蛋白并减少6xLaemli采样缓冲区分析10%SDS-PAGE凝胶Gels在100V运行1.5小时Proteins使用跨Blot半干转移系统(Bio-Rad实验室、CA实验室、USA)转接Nitrocellose膜(GE-Healthcuration公司、CA公司、IL公司和美国)1小时15V转接后,薄膜用PonceauS染色解法(SERVA电阻解法,海德堡,德国)测试成功蛋白转移,随后用4%滑雪奶粉阻塞室温1小时Louis,MO,USA)Tris缓冲salinep7.4(TBS)为0.1%Tween20(TBS-T)(Bio-Rad实验室,Hcels公司,CA公司,USA)。与TBS-T相隔一步清洗后,薄膜浸泡初级抗体稀释为4%bivee血清相簿(BSA)(Sigma-Aldrich St.Louis,MO,USA)TBS夜间4摄氏度隔天和几步用TBS-T清洗时,Membranes孵化二级抗体,TBS-T用4%牛奶稀释清洗后用OdysseyCLx视觉化并用图像演播室软件5.2版分析(均取自LI-COR生物科学网站LincolnNE,USA)。

美兰玛病人 Day-1 90天
派特 Gene大赛 岁数 普里姆姆 变异性 疗程 AJCC阶段 S100 LDHU/L PMNG/L LyG/L AJCC阶段 响应 S100 LDH系统 PMNG/L LyG/L 90天新转移
P1 m 55号 构造学 NRAS 尼沃市 三环 0.02 168号 3.4 1.8 三环 稳态 0.02 179 3.2 1.9 无新损伤
P2 m 75 贪吃性 NRAS 彭布罗 四 0.09 216 4.9 2.0 四 进度分析 0.09 272 6.5 2.0 肾上腺
P3 m 71号 平面图 N/A 尼沃市 三环 0.03 143 8.9 2.24 四 进度分析 0.05 153 6.6 1.7 inguinal语
P4 m 72 剖面图 BRAFV600E 尼沃市 三环 0.04 194 9.3 2.0 四 进度分析 0.06 186 7.9 2.1 脉冲切分
P5 m 69 倾斜 BRAFV600E Nivo和Pembro 四 0.32 813 8点0 1.7 四 响应 0.05 140 3.4 2.7 完全回归
P6 华府 56号 偶数化 N/A 尼沃市 三环 0.07 209 2.2. 1.8 四 进度分析 0.09 189 2.8 1.6 宫颈和脉冲
P7 m 51号 视觉学 CKIT Nivo和Pembro 四 0.05 178 4.5 1.1 四 进度分析 0.06 167号 2.7 1.0 脉冲和Hepata
派特 耐心身份证Gen性别AJCC 美国癌症联合委员会LDH液化脱水PMN多态核lekucyteLy淋巴细胞N/A,无可用性

表1病人数据细节

转换转换

稳定多表达DEL-1使用哺乳类扁豆基因表达系统DEL-1超表达式图集(VB90000-0562grx)购自VectorBuilder(Chicago,IL,USA),包装模集pspax2 (#12260)和信封模集pMD2.G (#12259)购自Addgene(Wotertown,MA,USA)。Plasmid GFP-pLVTHM (#12247)(Addgene,Fitertown,MA,USA)被用作负控件HEK293T丰度增长75% RPMI介质中6cm培养盘无抗生素转接前一小时HEK293T细胞用25M叶片处理并发自Lipsectrime2000(Invitrogen, ThemFish科学,Waltham,MA,USA)后,根据10mgDEL-1或控制基因表达法模Limi、1.75mgpMD2.G信封primi和5.25mgpsPAX2包装模6小时后,介质改换为无抗生素RPMI介质条件介质含扁叶矢量集聚24小时、48小时和72小时转录后收集、过滤并补充6mg/ml聚苯Louis,MO,USA)前加入MCM1DLN细胞,T-25瓶播种60-70%宽度72小时后细胞排序GFP表达法并分析DEL-1mRNA和蛋白表达法

关于细胞蛋白定位,从向量Builder(芝加哥、IL、USA)订购绿色荧光蛋白标签DEL-1(VB200505-128ave)并瞬时表达VM-14细胞编码meloma细胞播种80%宽度,用RPMI介质冲刷无补品,并用Lipoectoramine2000转介OptiMEM(Gibco, ThemoFish科学,Waltham,MA,USA)根据供应商建议使用Invitrogen,ThermoFish科学,Waltham,MA,USA48至72小时后,DEL-1-GFP表达式由qPCR分析,Western布局和免疫性分析

Immunofluorescence

总计每井1 500 VM-14细胞均按exi P-Slide 8井封状传播(Uii,Gräfeling,Dervice)并随绿色荧光蛋白标定DEL-1(VB200505-128ave)(VectorBuilder,Chicaco,IL,USA)构造编码瞬态移植PBS中4%假冒药固化10分钟,PBS洗三次并稳定化解法(20mmHeps、300mmsucrosse、50mmNacl、0.5%TritonX-1005分钟-20c使用PBS清洗后,主抗体在PBS稀释1%BSA并夜间4摄氏度插入额外清洗步骤后,二级抗体稀释PBS1%BSA幻灯片用LSM780相容显微镜和AiryScan检测器映射图像使用ArivisVision4D软件处理(Arivis,慕尼黑,德国)分解Exsoces与BlobFinder并发区域测量和事件计数

电细胞基阻抗感测

8W10E+ECIS阵列板(UCI,Gräfeling,Dervice)均衡后,37摄氏度时介质16小时后,HUVEC在Gelatin拼接电极机房上播种,密度为千分之12千分之300ml由62.5至6.4万赫兹不等多频段受阻测后使用ECISZ仪表持续监控(应用生物物理仪表,特洛伊州、纽约州、美国),前文描述[16]稳定高原4000Hz/PBS重构人DEL-1蛋白质6046-ED/R&D系统Minneapolis/MN/USA)和/或RGDpeptiLouis,MO,USA)加入细胞250赫兹转元抗变使用ECIS软件版本1.2.186分析(应用生物物理学,特洛伊州、纽约州、美国)。

质谱分析

Exsoces同前文描述的隔离并分解到PBS关于从黑素细胞线生成的外生物,根据制造商协议使用Exocome旋转柱MW3000执行低分子量污染物清除人类等离子异常样本省略此步骤后用一卷Exocome反悬浮缓冲和一卷2X反射解法(均取Invitrogen, Them Fish科学,Waltham,MA,USA)冲淡所有exocome样本,继之以二氯甲烷蛋白降水(Merck,Darmstadt,Dermstadt,Dermstat)和甲醇(themFish科学,Waltham,MA,USA)。简言之,三卷甲醇、一卷二氯甲烷和三卷蒸水添加到一个样本体积中,在-20摄氏20分取样本9000xg5分钟室温上相丢弃并添加三卷甲醇9000xg离心机10分钟后样本再次丢弃干粒溶解Louis,MO,USA)含0.1%rapiGestSF蛋白浓度用纳米分光计测量(DS-11、DeNovix、Wilmington、NC、USA)。20微米蛋白离散数使用5md二维思里托尔60摄氏30分钟并用15miiodoacetemideLouis,MO,USA)MS级sporcine试探文解析(1:20 w/w)(ThemFish科学,Waltham,MA,USA)在37摄氏度夜间执行并编译并存储1-80摄氏分解蛋白直到注入

纳米色谱分离使用纳米RSLCUTIMate3000系统(themFischerScience,Waltham,MA,USA)。PepMapC18陷阱栏使用300微米IDx5mm长度、5微米粒子大小、100o纳诺HPLC消化蛋白用200cmC18mPAC分离列(PharmaFlui微分PAC列尺寸为:5微米柱直径,2.5微米柱间距离,18微米柱高315m床通道宽度柱子表面疏松 端端加C18链

水载移动级包含2%ACN0.1%TFA和0.01%HFBA冷却到3摄氏度移动相位将样本从采样循环转入捕捉柱,加泵30ml/min转入捕捉柱,在50摄氏度时由柱炉操作捕捉时间定在10分钟内,足以把样本加到捕捉柱上并清洗可能的盐类和污染物冷却移动相能捕捉水益解析物提高炉温Peptides使用正NMHPLC-ESI-MS分离分析渐变分解混合由下列溶剂组成的两个移动相

移动A级:95%H2O、5%ACN、0.1%,FA

移动级B(MPB):50%ACN,30%MEH,10%TFE(2,2,2-Trifro乙醇),10%-0.1%FA

二百分钟后 陷阱列转回分离流 并均衡下一运行

因长分离路径,这些列的空积比传统打包纳米分离列高纳米HPLC泵流速设定前10分钟800nl/min并逐步下调至600nl/min11分钟分离分离运行结束时流率逐步提高至800毫升/分钟是为了加速平衡分离列开发测试二百cmmmPAC列不同梯度的细节由[17]描述

Expectiveptides使用UV214Nm(3nlUV电池,Excecete科学,德国Germering)和质谱测量法(QExpactivePlus,ExceiveFishScience,德国不来梅)进行检测应用下列分离梯度(表2):

质谱分析使用装有FlexNio-ESI源码和不锈发射针头的QExiewrap释放电压设置为3.1kV,扫描范围为200-2000m/z完全MS分辨率定为70000,AGC目标定为3E6,最大注入时间定为50msMS/MS分析质量分辨率定为35.000,AGC目标定为1E5,最大注入时间定为120msMS/MS隔离宽度定为m/z1.5,最大15离子选择分片处理,单加电离子和加电大于+7离子排除MS/MS动态排除时间定在20秒NCE设为30

RawMS数据与Proteome发现者2.4使用下列参数搜索人类ServicesProt蛋白数据库(Version 2020)修改:卡米多甲基C固定修改spitide容度设为10ppm和MS容度设为0.05Datrypsin选择用酶并允许两段漏取假发现速率定为1%,并使用诱因数据库搜索估计FDR

搜索生成单片细胞线SEV中>1383蛋白数和人体等离子样本SEV中>288蛋白数检测频率差异替代组间差异子蛋白组成计算,差分截取定值为50%数据可视化使用ClustVis工具[18]未对CCA块块和热映射显示数据应用中心或比例质谱蛋组学数据通过PRIDE伙伴存储器存入ProteomeXchange Consorti

时间分解 流出量 %A 百分位
0 800 95 5
10 800 95 5
11 600 97 5
百元 600 75 25码
150 600 40码 60码
151 600 10 90
160 800 10 90
161 800 95 5
240 800 95 5

表2百化物214nm

结果讨论

DEL-1mRNA阳性线中只有微量DEL-1蛋白在液晶体和超导体中可检测对比之下,强性蛋白表达法取自野型细胞SEV,更多取自DEL-1高表达式细胞SEV(图1a左侧面板补充图1显示其他DEL-1正反单元格线示例间皮瘤细胞描述DEL-1相似分解路径[20]预测分子大小DEL-1为52kDa65kDa检测到波段,与重构DEL-1大小相匹配,用中国仓鼠卵巢表示,表示相联性

分析DEL-1通过内分解路径释放后, 我们评估子细胞分布后再释放入外细胞空间VM14黑素细胞不释放DEL-1阳性sEV微博EEA1反体[8]EEA1系寄生虫蛋白封装显微镜显示,二维维-GFP组成环形结构,大小达1m,与EEA1合用(图1b并插入)。荧光标签结构大小测定显示EEA1正数DEL-1内负数结构小小(小于0.06微米2),EEA1和DEL-1双片结构为+0.06微米2(图1c),可能对应Exsocmal载货[22]

EVs大小不一标准差值超离差协议用于分离微粒子st超离心步骤30分钟18000xgst超离心步骤120分xg西色分析显示DEL-1主要是2后SEV检测st超离心步骤(含外生素)微粒内分量小,细胞培养超生素中无法检测蛋白质(图1a右侧面板图1)。虽然我们对EV子群描述不完全满足协商一致论文公布的标准,但用激光扫描显微镜测定DEL-1-GFP正值SEV分数的大小分布范围为0.03-0.09m2,该范围在exosomes范围以内(图1d)。此外,根据协商一致文件的蛋白内分量剖析显示,二步离心协议后黑素衍生SEV含有EV定性所需大多数类别1蛋白质(见方法)[15]

流转黑素细胞远程器官场点隐含附带和移位这些事件需要透视激活 通过特定粘合分子包括整形特别是含有RGDmotif的蛋白质已知激活内向异变,从而引出内向反移[24]曾显示表示DEL1mRNA的黑素细胞引起共生接合器中断ESIS®使用系统评估内分层连接式蛋白DEL-1对内分层完整性和转元抗药性效果DEL-1引出直交屏障明显中断(图1e)。DEL1内含RGD指1,但并发RGDPiptide

深入描述DEL-1+或DEL-1之间的差异-sEV原型剖析8条不同黑素线的sEV主构件分析基础为质谱学蛋白检测出两种不同的集群(图2a),明显区分sEV从扩散性/DEL1-和入侵性/DEL-1+单元格[8,13]检测频率图2b显示这些蛋白质评估时,如果能用它预测病人治疗响应,6名接受检查站抑制处理的血浆病人的血浆SEV是在前后90天收集的。病人P1稳定疾病,P5响应P2、3、4和6远程转移可惜从1ml等离子体微积分微弱,仅能识别122+35蛋白质/病人样本DEL1在任何样本中都无法检测

低蛋白分量无疑是本分析的局限性,以及病人SEV中缺少可检测DEL-1,甚至在肿瘤增量的病人中也是如此。重要的是,主构分析允许明确区分控件和病人,并在一定程度上区分处理前后(图2cd)。有趣的是,P5病人的SEV原型剖面图显示完全回归,保留在预处理集群中

图1DEL-1局部分解成内分解结构,通过sEV隐蔽并导致内分屏中断a)左面板:WesternBlot分析DEL-1全单元解析器、文化超生和sEV单接MSPDLN野型和DEL-1超表达式二步协议右面板:Western布洛特分析st超离心步骤计时30分钟18000xg,2后插入SEV后端超离心步骤120分整体细胞解析层中52kD带的性质仍然开放,但可能与52kD非晶化DEL-1预测分子规模相匹配(3重复的典型例子)。oex表示超表达式,wt表示野型b共定位显示为黄箭头表示早期内分解插入显示量化强度剖面图A点和B点确认DEL-1-GFP和EEA1的共同定位EEA1正/DEL-1负双正细胞结构分布d)DEL-1-GFP正值SEV除以二步差超离差分析ECIS实验用10mg/ml重构DEL-1、35mg/mlRGDpeptide组合或PBS控制250赫兹横向电阻监测2小时并显示ohms阻抗变化值显示为平均值++SD单向ANOVA计算2小时后阻抗变化统计意义s无关紧要,****p <0.0001n=##6.

图2素数剖析从培养黑素细胞和等离子体SEV从健康捐赠者与黑素患者前和后检验抑制处理a) 主构分析质谱数据显示SEV(由2步超集中化协议隔离)与表示入侵和扩散细胞线之间的质差对应热图50差分表示蛋白质75%检测差PCA图显示血浆SEV聚类(单片2步超点化协议),取自有不同健康状况的主体(健康预处理和后处理)。对应热图29差分表示蛋白质组间,差分定值为50%

结论

DEL-1被认为是隐式分子,在细胞培养超级目录中找不到,但在黑素细胞中通过eV导出DEL-1+sEV取自细胞培养超级子数共表达多项与攻击性癌症相联的蛋白质,如聚类素、viculin、versican、ezrin、CD87、neurplin1、SERPINE1、pentrixin3、calreticulin微小样本大小和从等离子体SEV生成的微弱蛋白分量是我们研究的明显限制与健康控件相比,病人SEV预处理和后处理蛋白表达剖面的明显差异要求进一步研究分析它预测处理响应的潜力

数据可用性

参与病人数据健康控件和材料方法在补充材料中描述质谱蛋组学数据通过ProteomeXchange公开提供,标识符PXD025475更多支持本条的数据可应合理请求获取

利益冲突

作者声明无利益冲突

作者贡献

概念化:PP

病人样本采集:FT

数据曲线:MSGMGH

形式分析:PP、MS、GH、MG、JW

获取资金:无

调查:MS、KN、GM、MG

方法:MS

软件:GH

监督:PP

验证:PP

可视化:MSGHM

写-原创编程:MSP

写-审查编辑:MSP

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