人类肠道中的微生物组随着时间的推移而发育，最终为个人提供益处。这些益处涉及改善的免疫力，包括提供对致病微生物的抵抗力，以及在发育过程中处理胃肠道废物和对代谢的调节。因此，化疗对肠道微生物的影响可能对癌症患者的健康有影响。在这项研究中，我们评估了化疗的影响大肠杆菌作为化疗前后肠杆菌科活性的指示种。我们分离大肠杆菌来自癌症患者化疗前后的粪便样本。在20名患者中，有3人感染了大肠杆菌化疗前后的粪便样本。通过提取DNA来鉴定细菌，并从生化活性方面检查其变化，包括产生酸和气体，以及钾、磷、钠和氯化物泄漏到培养基中。我们用扫描电子显微镜观察了细胞形态，并对其基因组进行了分析大肠杆菌被R16s对测序。结果表明治疗后细胞的损伤，特别是在治疗前后和之后生产气体和酸的酸和酸泄漏以及磷，钾，钠和氯化物。总体而言，我们的研究结果表明，化疗对肠道细菌有明显的影响。

肠道微生物群，大肠杆菌化疗，分子鉴定。

人类肠道中的微生物组随着时间的推移而发育，最终为个人提供益处。这些益处涉及改善的免疫力，包括提供对致病微生物的抵抗力，以及在发育过程中处理胃肠道废物和对代谢的调节。因此，化疗对肠道微生物的影响可能对癌症患者的健康有影响。在这项研究中，我们评估了化疗的影响大肠杆菌作为化疗前后肠杆菌科活性的指示种。我们分离大肠杆菌来自癌症患者化疗前后的粪便样本。在20名患者中，有3人感染了大肠杆菌化疗前后的粪便样本。通过提取DNA来鉴定细菌，并从生化活性方面检查其变化，包括产生酸和气体，以及钾、磷、钠和氯化物泄漏到培养基中。我们用扫描电子显微镜观察了细胞形态，并对其基因组进行了分析大肠杆菌被R16s对测序。结果表明治疗后细胞的损伤，特别是在治疗前后和之后生产气体和酸的酸和酸泄漏以及磷，钾，钠和氯化物。总体而言，我们的研究结果表明，化疗对肠道细菌有明显的影响。

肠道微生物群，大肠杆菌化疗，分子鉴定。

最近的研究表明，肠道的微生物群对健康有着深远的影响。大多数肠道微生物通过保护宿主不受肠道病原体的侵袭和促进正常的免疫功能，从而使宿主受益。此外，它们从食物中提取营养和能量，合成必要的维生素和氨基酸，并帮助降解毒素。从出生开始，人体就孕育着微生物，直到成年，微生物的数量不断增加;在成人中，组成菌群的微生物细胞比人体细胞的数量要多[1-4]。人类最重要的微生物群之一是居住在人体肠道内的微生物，称为微生物群。宿主体内肠道菌群的平衡与癌症、神经系统紊乱、炎症性疾病、肠道疾病、肥胖和营养不良有关[5-6]。对小鼠肠道微生物群的研究表明，该微生物群能促进肠道内单糖的吸收[5,7-9]，这凸显了这些微生物的重要性。

结肠微生物群调节饮食中某些有机化合物的消化。然而，值得注意的是，在饮食中摄入益生菌和益生元可以改变微生物群的结构和代谢活动[9-11]。作为益生菌的食品补充剂包括酸奶和含有双歧杆菌的乳制品；这种革兰氏阳性杆菌样细菌是非致病性、非基因毒性和非消化性的，并显示出与刺激细胞生长或活性相关的优势。此外，乳酸杆菌和双歧杆菌已被证明可以改善结肠的健康状况[12]。事实上，定植于胃肠道的益生菌具有支持人类胃肠健康的代谢功能，可能与宿主生理学有关[13]。

大肠杆菌是从所有健康新生儿[14]的粪便中分离出的最常见的兼性种。基于文化的研究表明，所有健康的成年人都有共同的肠道细菌物种作为核心微生物群。例如,大肠杆菌可以与大多数人隔绝[6]。然而，肠道菌群可被许多内源性和外源性因素改变，包括饲养、年龄、性别、习惯、生理功能、免疫机制、内源性微生物、饮食、药物、情绪应激等[15-18]。

同样，化疗和抗生素也会引起严重的副作用，如粘膜炎、腹泻和便秘。这些副作用增加了医疗服务的成本，而且往往危及生命。癌症患者的抗生素和化疗也会影响肠道微生物群，从而改变肠粘膜，增加艰难梭菌感染的风险，导致炎症并发症[19-23]。在其他研究中，癌症化疗加抗生素的使用已经被证明会破坏粪便微生物生态系统，导致化疗后立即减少物种丰富度[23-25]。化疗引起的粪便微生物群变化与全身效应有关，可促进化疗引起的粘膜炎的发展，从而影响微生物生态系统[26]。

在这项研究中，我们探讨了化疗对癌症患者的影响大肠杆菌活动，包括钾，磷，钠，氯泄漏以及酸和气体的生产。此外，我们还研究了化疗对细菌特性的影响，包括细胞壁形态和分子特征。

阿卜杜勒阿齐兹国王大学医院伦理委员会和Erfan和Bagedo综合医院批准了该研究方案(2016年2月24日和2016年11月17日批准号分别为D/37/62998和011016)。

收集癌症患者化疗前后1周的粪便样本，每个样本10 μL接种于亚硒酸盐培养液中，37℃好氧培养24 h后纯化。一微升在血琼脂上划线，在37℃下孵育24小时。样品交替地在MacConkey琼脂、血琼脂和巧克力琼脂上划线，在37℃下孵育24小时。每个测试重复进行三次。组合板(NMIC / ID-26;目录没有。用448026)进行鉴定。根据制造商的建议，使用CrystalSpec浊度计(BD Diagnostics, Sparks MD, USA)将纯培养的菌落调整为0.5 McFarland标准。倒入25 μ l等量的悬架以确定Phoenix面板的ID侧。在规定的时间轴30分钟内，将标本记录并装入仪器。获得完整的ID结果所需的时间在8 - 12小时之间变化。 Identification of the bacteria was performed at Maternity & Children’s Hospital in Jeddah, Saudi Arabia.

通过计算培养基中钾、磷、钠和氯的比例来估算细菌的次级代谢。钾、磷、钠和氯离子流出根据前面描述的方法进行测定[28-29]。细菌悬浮液中游离钾、磷、钠、氯离子的浓度大肠杆菌在将细菌细胞暴露于营养肉汤中30、60、120、240、480或720分钟后测量。混合物在37℃下培养。每管重复三次。在每个预先确定的时间间隔内，使用光度法程序（钾的EasyRA Medica和磷的COBAS INTEGRA 400 plus）测量细胞外钾、磷、钠和氯化物浓度。结果用生长培养基中细胞外游离钾、磷、钠或氯离子的量（mM）表示。每种治疗方法一式三份。

接下来，我们比较了能力大肠杆菌在化疗前后产生酸和气体。MacConkey肉汤Durham管接种10 μL 24 h大肠杆菌然后将悬浮液和管在37℃下孵育24小时。记录了Durham管中的可见气体生产，使用Eutech Instruments pH 700（Thermo Scientific）进行评估酸[30]。每种培养物评估一式三份。

目的评价分离株的形态特征大肠杆菌化疗前后行扫描电镜观察。大肠杆菌选取细胞进行实验。细菌在[31]培养基中培养24 h。培养物在37℃下培养，然后离心，在9800 × g的条件下分离细菌细胞大肠杆菌将细胞涂在铜柱上，阴极喷涂极化子金，在汞灯下干燥5min，观察细胞形态大肠杆菌用扫描电子显微镜（JEOL型号JSM-7600F）观察细胞[32-33]。在AbdulZZIZ大学纳米中心扫描样品。

用Qiagen DNA提取试剂盒[34]提取分离的细菌DNA。为了分离基因组DNA，将在37°C琼脂平板上过夜培养的菌落悬液中的10 μL细胞转移到1.5 ml Eppendorf管中。细菌DNA提取使用Qiagen DNA试剂盒，每个类型的细菌都有特殊的协议。对于革兰氏阴性菌，重悬球置于180 μL a Tissue Lysis buffer中，加入20 μL蛋白酶K。然后通过涡旋将样品彻底混合，并在56°C孵育至组织完全溶解。样品经涡旋混合15s后加入200 μL缓冲液。样品再次涡旋混合，加入200 μL乙醇(96-100%)，涡旋混合。将混合物移液到DNeasy Mini旋转柱中，放入2ml收集管中。然后以8000 rpm离心1 min。将DNeasy Mini旋转柱置于新的2 ml收集管中，加入500 μL AW1缓冲液，8000 rpm离心1 min。将DNeasy Mini旋转柱置于新的2 ml收集管中，加入500 μL AW2缓冲液，14000 rpm离心3 min。 The DNeasy Mini spin columns were then placed in clean 2-mL microcentrifuge tubes, and 200 μL buffer AE was pipetted directly onto the DNeasy membrane. Samples were then incubated at room temperature for 1 min and centrifuged for 1 min at 8,000 rpm to elute the DNA. The isolated DNA samples were stored at -20°C according to the manufacturer’s protocol, as outlined in the DNeasy Blood and Tissue Handbook [35].

琼脂糖凝胶电泳用6倍缓冲液（5:1）混合制备DNA样品，置孔中。三微升的DNA阶梯也被电泳。使用Thermo ECECEC135-90电泳电源（Thermo Electron，USA）进行电泳（SCIEPLAS UK），设置如下：130 V，100 Amp，约1.3 h。通过肉眼观察跟踪染料的迁移，判断DNA在凝胶中的迁移距离。

采用溴化乙锭染色法在紫外光下观察DNA条带。采用聚合酶链反应法扩增16S基因，引物分别为518F 5 ' - ccagcaggcggtaatacg -3 '和800R 5 ' -TACCAGGGTATCTAATCC-3 '。根据16S基因的518F和800R基因组序列[36]中的保守区设计引物。提取的DNA用Macrogen (https://www.macrogenusa.com/)进行测序。测序数据采用BLAST-NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih。gov / Blast.cgi)。

收集微生物抑制区和细胞计数（CFU / mL）的数据，总结和制表。使用社会科学统计包进行统计分析（Windows的SPSS，版本16; SPSS Inc.，芝加哥，IL，美国）。结果的可变性表示为平均值±标准偏差。使用方差分析确定样品与基团之间的均匀性之间的差异的重要性。p值小于0.05的结果被认为是显着的。

参考资料采用APA格式，它们是通过使用Endnote Thomson Reuters软件版本X7执行的。

本实验旨在检测生物化学活性之间的相互作用大肠杆菌化疗前后分离1周。结果显示在表1-4中。

*第≤ 0.05
**p≤0.01
平均值±标准差。

*第≤ 0.05
**p≤0.01
平均值±标准差。

*第≤ 0.05
**p≤0.01
平均值±标准差。

*第≤ 0.05
**p≤0.01
平均值±标准差。

如表1所示，培养1h后观察到磷渗漏大肠杆菌1例患者化疗1周后分离株。2 h后泄漏量增加至15.66%，随着培养时间的延长泄漏量逐渐减少，到12 h时达到治疗前1周的泄漏量。观察到两个趋势。首先，部分样品在4 h前磷泄漏量增加，4 h后磷泄漏量下降到6.98%;另一株随培养时间的延长，磷漏率逐渐降低，4 h后达到38.33%，12 h后下降至7.50%，差异极显著(P≤0.01)。

钾渗漏值如表2所示。钾渗漏增加大肠杆菌患者治疗前1周分离的菌株与治疗后1周分离的菌株进行比较。随着培养时间的延长，12 h后钾漏率降低至1.32%大肠杆菌另一位患者在化疗前和化疗后表现出钾渗漏的不同相互作用。第一株菌钾漏量随培养时间的延长而降低，培养2 h后达到9.10%。4、8 h后，钾渗漏率分别上升到2.76%和9.10%，12 h后下降到4.67%。第二株在整个培养过程中，钾渗漏率下降，2、4 h后分别下降了32.47%和27.92%。这些结果极显著(P≤0.01)。

钠泄漏值见表3。钠泄漏之间的大肠杆菌化疗前和化疗后从患者1和2和菌株之间分离。对于患者1，钠漏在孵育1小时后增加大肠杆菌处理后与处理前同孵育期相比，孵育2 h至孵育结束时钠漏率为2.56%，12 h后钠漏率进一步降低至2.44%。患者2化疗后钠漏量较化疗前进一步减少;化疗后分离的第1株和第2株的下降幅度不同，第2株的下降幅度大于第1株(孵育1 h后分别为7.89%和42.11%，孵育12 h后分别为3.76%和30.84%)。培养4 h后各菌株间的相互作用变化较大，1株增加到2.03%，2株减少到24.24%。这些结果极显著(P≤0.01)。

氯离子泄漏值见表4。氯泄漏大肠杆菌从患者1中分离到8 h后上升至3.10%，12 h后下降至0.53%大肠杆菌来自患者2的抗氯化物泄漏的降低，除了第一个菌株的4和8小时外，分别增加1.08％和1.07％。在孵育2小时后，第二种菌株显示出剧烈降低29.97％。这些结果极显著(P≤0.01)。

产气量和产酸量如表5、图1和图2所示。值得注意的是，从患者1分离的菌株在化疗后产气量减少，而从患者2分离的菌株在第一个菌株中没有产气量，在第二个菌株中产气量增加。此外，酸的生产大肠杆菌患者1和8.44％在患者的第二株中减少至8.44％。这些结果非常显着（P≤0.01）。

**p≤0.01
介质:气体出现在达勒姆管的一半。
低：气体出现在达勒姆管的四分之一处。
平均值±标准差。

生物化学相互作用大肠杆菌磷，钾，氯化钠，氯化钠和酸和天然气产生的菌株在化疗前后的生化活性相互作用，除非患者1具有促进的阴离子和阳离子相互作用。

如图3所示，扫描电镜大肠杆菌与化疗前相比，从患者1分离的细胞显示化疗后聚合物生成减少。细胞表面变形光滑。相反，如图4所示，扫描电镜大肠杆菌从2号病人分离到的细胞与化疗前相比，化疗后细胞壁损伤更大，出现空洞、收缩、聚集、破裂和变形。

如图5-12所示，对于化疗前从患者1分离的菌株的鉴定，16S核糖体DNA鉴定显示该菌株为大肠杆菌菌株U 5/41，基于97%的共享序列，有8个位点与参考菌株匹配。化疗后，大肠杆菌菌株JCM 1649同源性达95%，6个位点与参考菌株匹配。在患者2化疗前，大肠杆菌用96％的同源性和六个位点鉴定菌株JCM 1649。化疗后，大肠杆菌菌株nbrc102203的同源性为98%，有8个位点与参考菌株相匹配。

钾，磷，钠，氯从大肠杆菌化疗前后的细胞可能是由于化疗对细胞质膜通透性的影响而导致细胞调控受损。一些研究已经证实了阴阳离子对细胞能量和代谢的影响[37-43]。磷酸基团作为主要的缓冲阴离子;然而，细胞必须使用几种一价阳离子，包括钾作为主要的细胞阳离子。控制钾离子运动的一个参数是细胞质pH. In大肠杆菌，有两种机制调节这种效应，并根据这些机制所处的pH范围而变化;也就是说，一种机制在碱性环境中起作用，另一种在酸性环境中起作用[38]。钾的流入大肠杆菌对于恢复其膨压是必不可少的，是渗透挑战后生长所必需的，而谷氨酸水平仅在渗透休克后略有增加。介导钾摄取的转运体似乎是由膨压控制的，尽管在分子水平[37]上尚未确定渗透压力细胞中涉及钾摄取的系统。

化疗的影响大肠杆菌细胞，如酸和气体的产生，可能是由于细菌抵抗细胞壁损伤和细胞质膜的渗透性的影响。然而，分离出来的菌株大肠杆菌有能力发酵乳糖和产生酸和气体。几项研究证实了气体和酸产量的变化，支持了我们目前的发现大肠杆菌在某些条件下有可能产生酸和气体[44-45]。在电子显微照片中可以观察到细胞壁的损伤，这可能是由于化疗中的活性化合物引起的，这些活性化合物可能导致细胞内的渗透压或破坏细胞膜的调节。关于抗生素对细胞壁、细胞质膜通透性以及酶、蛋白质和毒素功能的影响，也有类似结果的报道[29,46-50]。

在孤立的大肠杆菌化疗之前和后可能是由几个因素引起的。例如，化疗后微生物群的重整可以让适应新的菌株大肠杆菌在恶劣环境中增长的能力更大。或者，主要的大肠杆菌我们的实验证明，化疗后会发生变化。值得注意的是，菌株U5/41（DSM30083、JCM1649和NBRC102203）已被鉴定为血清型O1:K1:H7。分离菌株间的差异大肠杆菌U 5/41、JCM1649和NBRC102203分别在系统发育、基因型和表型水平上进行鉴定。发展史和病理可能高度相关,可以诱导病理改变只有一个或两个基因,如tynA和csgD基因不过,新菌株极其丰富的噬菌体原,macrocolony和生物膜的形成,和游泳运动已确定和特点的女性尿微生物群(51-55)。

在本研究中，我们研究了化疗对大肠杆菌作为一种肠杆菌科的癌症患者。我们的研究结果表明，化疗可能导致细菌产生新的代谢功能。因此，我们建议化疗应与益生菌营养系统一起在适当的医疗监督下进行。

我们要感谢Erfan & Bagedo总医院对这项研究的协助。