摘要目的:茉莉酸甲酯(MJ)是一种亲脂性挥发性有机化合物，起源于植物中的应激激素。MJ参与植物防御和许多其他不同的代谢途径。该激素通过map激酶途径产生，以对抗植物的生物和非生物胁迫。MJ在不干扰正常细胞生长的情况下对癌细胞具有选择性抗增殖作用，在人体有治疗潜力。

方法:用不同浓度的MJ处理人肺癌细胞系(A-549)。采用MTT法检测癌细胞活力。在MJ的硅片对接中，利用Auto对接工具2.6、Marvin view 5.8.1、CLC主工作台3.0和Discovery studio 3.0进行了对接。

结果:当MJ浓度为0.31、0.62、1.25、2.5、5和10 mM时，其亚细胞毒性对细胞活力的影响分别为91、89、87、76、50和21%。MJ与肺癌细胞葡萄糖摄取通道转运蛋白葡萄糖转运蛋白1 (GLUT1)和己糖激酶2 (HK2)对接。这两种蛋白在肺癌细胞中被阻断后，转入无葡萄糖源的缺氧状态，导致细胞凋亡。

结论:MJ直接结合GLUT1，自由能结合-4.91kcal/mol，阻断高糖酵解肿瘤细胞对葡萄糖的吸收。MJ还与己糖激酶- ii (HK2)结合，自由能为+13.69kcal/mol，使HK2从电压依赖性阴离子通道(VDAC)分离。

肺癌;茉莉酸甲酯，葡萄糖转运蛋白1，己糖激酶ii，电压依赖性阴离子通道。

摘要目的:茉莉酸甲酯(MJ)是一种亲脂性挥发性有机化合物，起源于植物中的应激激素。MJ参与植物防御和许多其他不同的代谢途径。该激素通过map激酶途径产生，以对抗植物的生物和非生物胁迫。MJ在不干扰正常细胞生长的情况下对癌细胞具有选择性抗增殖作用，在人体有治疗潜力。

方法:用不同浓度的MJ处理人肺癌细胞系(A-549)。采用MTT法检测癌细胞活力。在MJ的硅片对接中，利用Auto对接工具2.6、Marvin view 5.8.1、CLC主工作台3.0和Discovery studio 3.0进行了对接。

结果:当MJ浓度为0.31、0.62、1.25、2.5、5和10 mM时，其亚细胞毒性对细胞活力的影响分别为91、89、87、76、50和21%。MJ与肺癌细胞葡萄糖摄取通道转运蛋白葡萄糖转运蛋白1 (GLUT1)和己糖激酶2 (HK2)对接。这两种蛋白在肺癌细胞中被阻断后，转入无葡萄糖源的缺氧状态，导致细胞凋亡。

结论:MJ直接结合GLUT1，自由能结合-4.91kcal/mol，阻断高糖酵解肿瘤细胞对葡萄糖的吸收。MJ还与己糖激酶- ii (HK2)结合，自由能为+13.69kcal/mol，使HK2从电压依赖性阴离子通道(VDAC)分离。

肺癌;茉莉酸甲酯，葡萄糖转运蛋白1，己糖激酶ii，电压依赖性阴离子通道。

肺癌是世界上最常见的癌症，每年造成138万人死亡，占癌症死亡总数的18.2%[1]。肺癌分为小细胞肺癌(SCLC)和非SCLC (NSCLC)。大多数非小细胞肺癌患者是在晚期诊断的，因为临床结果差，导致生存率低。它占所有肺癌的80%。SCLC是由吸烟和香烟烟雾中的致癌尼古丁引起的。在美国，肺癌确诊后5年的生存率为15%，在发展中国家为8.9%[2]，在疾病的晚期，有限的诊断潜在原因检测[3]。不同的治疗技术如化疗、放疗和冷冻手术控制或杀死肺癌细胞，并伴随副作用[4]。

因此，需要更特异性的靶向治疗，预后更好。茉莉酸甲酯(MJ)是植物的一种应激激素。它是氧脂类挥发性化合物。植物在非生物胁迫和生物胁迫下都会产生MJ, MJ作为信号分子与同一物种的其他植物接触，从而触发它们对各自胁迫[5]的防御机制。最近的证据表明，MJ可以抑制黑素瘤细胞的迁移，抑制黑素瘤在小鼠肺[6]生长的发展。然而，在人体中，MJ在体外和体内均显示出对癌细胞的治疗潜力，而不影响正常细胞。因此，MJ是一种很有前途的癌症治疗剂。美国联邦环境保护署(EPA)发现，毒性数据表明，通过所有接触途径，包括口服[7]，MJ对人类几乎是无毒的。它是安全的，可以作为人类饮食的天然组成部分，只对癌细胞有抗增殖作用。MJ对所有类型的癌症[8]具有高度的抗癌活性。 MJ performed its action on cancerous cells by multifaceted modes. In the present study we have focused on effect of MJ on A-549 lung cancer cell line and evaluating in silico targeted site for MJ through microarray data analysis.

肺癌细胞系A-549从印度浦那的NCCS获得。采用dmemi - f12培养基(Gibco)，添加10%胎牛血清(Gibco)和青霉素(100 U/ml)作为培养基。细胞保持在37°C(95%湿度，5% CO)₂)．将MJ (Sigma)溶解在浓度为10 mM的二甲基亚砜(Sigma)中，并保存在−20°C。融合的单层细胞与不同浓度的MJ孵育。50%的抑制浓度(IC₅₀)在暴露于MJ[9] 24小时后测量。

癌细胞在5×10的96孔板中培养⁴用不同浓度的MJ处理。用2-(4,5 -二甲基三唑-2-基)- 2,5 -二苯基溴化四唑(MTT, Sigma)比色法[10]监测细胞活力。所有实验均重复3次。吸光度在570 nm处测量，背景吸光度用630 nm[11]参考滤光片测量。细胞活力计算公式为:细胞活力= [O.D.of Blank - O.D. of Test]/O.D.的空白。

基因表达芯片数据来自于肺癌细胞和正常肺细胞的基因组尺度转录组分析。

基因表达综合(GEO):数据来自NCBI的GEO数据集，登录号为GSE-43346，下载部分。该软文件格式为简单的行格式，包含微阵列实验[12]的所有数据和描述性信息。图1为微阵列数据简单流的处理过程。下载的实验芯片数据组为正常肺细胞(GSM1060752)(组1)和癌肺细胞(GSM1060792)(组2)。差异基因

基因表达综合(GEO):数据从NCBI的GEO数据集登录号GSE-43346下载部分收集，软文件格式是简单的基于行的，包含微阵列实验[12]的所有数据和描述性信息。图1为微阵列数据简单流的处理过程。下载的实验芯片数据组为正常肺细胞(GSM1060752)(组1)和癌肺细胞(GSM1060792)(组2)。差异基因表达在CLC主工作台中进行，基于Kal等人的检验(z检验)进行计算。根据p值<0.0005和倍变差>1[13]筛选基因。利用HG-U133平台注释文件查找目标蛋白。通过CLC工作台得到的值为(1)Range:该值为阵列在正常肺细胞和癌肺细胞上的最高表达值和最低表达值之差。(2) IQR:表示数组值在样本间的分位数范围，即75%百分位值与25%百分位值之间的差值。

IQR设置为最大值和最小值之间的差值。(3)差值:值包含分配给组2的样本的表达式值的平均值与分配给组1的样本的表达式值的平均值之间的差值。(4) Fold Change:表示第2组的平均表达值相对于第1组的平均表达值大多少倍[14,15]。通过变换过程对这些比较组的数据进行质量控制检验，仔细检查表达式值的不一致程度取决于均值。这是由MA Plot完成的，它有助于将每个阵列与包含所有阵列上所有探测集的中值强度的伪阵列进行成对比较，并在所有阵列之间进行成对比较。转换过程是取表达式比(Log2[表达式比])[16,17]的2值为对数。它的主要优点是平等地对待差别的上调和下调。需要确保所有的样品是可比较的。

归一化:样品之间的系统差异可能是由于噪声(例如样品制备和加工的差异)，而不是真实的生物可变性。箱线图用于检查和评估正常肺细胞和癌细胞畸形表达值的总体分配。盒图在不同阵列上评估日志转换数据的规模和分布是类似的。盒子的形状或中心的差异表明需要规范化的数据，使转录组数据完全可比较[19]。分位数归一化是一种使正常和癌肺细胞表达值分布一致的统计学技术。对归一化数据拟合加性线性模型，得到每个基因芯片上每个探针的表达量。探测集的线性模型可以写成:Yij= mi+ aj+ eij。式中，Yij为i ?对应的归一化探测值^th基因芯片和j^th探查集中的探查，mi-表示与I杂化的样本中探查集的对数尺度表达式^th基因芯片，aj-表示对j的探针亲和效应^th探测集内的探测，eij-表示随机误差项。Tukey的中值优化用于获得mi值的估定值。这些估计作为与探测集相关的对数尺度表达式度量[20,21]。

主成分分析:对于主成分分析(PCA)[22]，正常和肺癌细胞系的转录组数据必须相对一致且显著明显。主成分分析是高维数据可视化和数据预处理的标准技术。通过计算正常细胞系和肺癌细胞系转录组数据之间的距离进行质量控制分析。欧几里得距离(E)矩阵可能是最熟悉的距离度量，因为它反映了空间中两个物体之间的距离(=直的“像乌鸦一样”的距离)。距离可以从0到正无穷。由式可知，具有表达数据的基因可用于n-条件，表示为x= [x1，…]和y= [y，…], yn]。两个基因之间的欧氏距离是每个条件(维度)[23]值之间距离平方和的平方根。

$$E（x，y）＝\sqrt{{\displaystyle \underset{我＝0}{\overset{n}{\sum }}{（x_{我}-y_{我}）}^2}}（1）$$

现在，通过高斯数据t检验统计分析来确定差异表达的基因(=在一组中表达明显高于另一组的基因)。t检验“同质性”用于比较两组和计算，假设组有相等的方差。Kal等人的检验(z检验)[24]，将单个样本与另一个单个样本进行比较，因此要求实验中的每组只有一个样本。检验依赖于通过正态分布对二项分布的近似。现在，火山图显示了统计检验的p值与组中样本表达值差异的大小之间的关系。y轴是log的负值₁₀(p值)在HG-U133平台[25]上绘制并导入注释文件。

分子对接:使用Marvin View、Autodock和Discovery Studio进行对接和对接相关研究。

MJ浓度依次增加0.31、0.62、1.25、2.5 5 ~ 10mM时，细胞活力分别下降91、89、87、76、50和21%(图2)₅₀和IC90值分别为4.937mM和7.822mM可见，MJ对A-549癌细胞的活性和增殖有明显的浓度依赖性抑制作用。

差异基因表达数据来自NCBI数据库GEO (gene expression Omnibus)登录号GSE-43346[30]。MA图是用来测量阵列质量的，它可以观察到表达式值中依赖于均值的方差。在ma图中，x轴a上的图4A与未转换数据中的M进行了对比，M是基因在两个阵列(Intarray2 - Intarray1)上强度的差值，a是基因的平均强度((Intarray2+Intarray1)/2)。tarray 1为正常细胞系，tarray 2为癌细胞系。图4B表示log2变换后的散点图。；

$$\text{米}＝{\text{日志}}_{\text{2}}（\text{Intarray 2}）-\; -\; -\; -\; -\; -{\text{日志}}_{\text{2}}（\text{Intarray 1}）＝{\text{日志}}_{\text{2}}\frac{\mathrm{Intarray}2}{\mathrm{Intarray}1}$$．

$$\text{一个}＝\frac{{\text{日志}}_{\text{2}}（\text{Intarray 2}）+{\text{日志}}_{\text{2}}（\text{Intarray 1}）}{2}$$

在图4A中，ma图中的数据点云以M=0为中心(浅灰色线)，因为大多数基因没有差异表达。此外，在不同的数组-数组组合中，M值的可变性应该是相似的。图显示，方差随着平均强度的增加而增加。数据已经进行了日志转换，以删除图4B中的一些依赖项。此外，对数转换将使数据更少的倾斜和更正态分布，这提供了一个平等的向上和向下调节的表达式比的扩散。

箱形图由中位数、上、下四分位范围组成，显示个体极值，评价数据的规模和分布是否具有可比性(数据归一化)。

用盒图比较数据集阵列之间的探测强度水平，盒端代表上、下四分位数，中间的线代表中位数，水平线代表最大值和最小值异常值。离群值是距离第一和第三个四分位数(框的边缘)的四分位数范围的1.5倍以上的值;图5A中阵列的强度等级与阵列的其他部分不同，需要通过归一化进行校正。图5B表示归一化箱线图后，中位数在同一直线上。

PCA将数据转换为“主成分”。主成分是原始变量的线性组合，在目前的情况下，特征是基因。主成分的排序方式是，第一个主成分是特征的线性组合，它捕获了数据集中最大变化的方向。在图6中，两个主成分都是空间中的一个轴，所以可以将每个样本投影到这个轴上，投影样本之间的方差将是第一个轴的所有可能选项中的最大的。第二个主分量是空间中的另一个轴，垂直于第一个轴。将样本投影到两个轴上，生成样本之间的变化尽可能大的图(图6)。

k -均值聚类将每个点分配给中心最近的聚类。簇的中心被定义为簇中所有点的平均值。如果一个数据集有三个维度，集群有两个点，X = (x1;x2;x3)和Y = (y1;y2;y3)，那么质心Z变成Z = (z1;z2;Z3)，当I = 1时，zi = (xi + yi) =2;2; 3.

该算法试图最小化由以下定义的簇内方差:$J＝{{\displaystyle \underset{j＝1}{\overset{K}{\sum }}{\displaystyle \underset{n\in {\mathrm{年代}}_j}{\sum }|x_n-{\mu }_j|}}}^2$

其中有k个簇Sj;j = 1;2;…;k和j是所有点xn2 Si[31]的质心。聚类的结果是几个图。数量取决于所选分区的数量图7每个集群有一个图。每个聚类的表达水平都有不同的模式，在火山或散点图中选择该聚类的特征。这将导致精度的提高和减少聚类时间的成员分配给聚类，以寻找距离的形式得到更好的结果，有精确的质心和去除不需要的噪声数据。

对时间过程数据进行单因素方差分析(anova)，结果显示54674基因中，72个基因磨损差异表达p值<0.0005，倍变(差)>1图8A[32]。对过滤后的数据进行基因注释(图8B[33])。其中选取前两个蛋白GLUT1和己糖激酶2与MJ对接。

火山图结果显示，转运蛋白是肺癌细胞中高度差异表达的蛋白(图8B)。通过下载最初使用Affymetrix芯片生成的微阵列数据，导入用于注释阵列的注释文件。注释文件可从Affymetrix网站(http://www.affymetrix.com/ support/technical/annotationfilesmain.affx)下载。NCBI数据集的GEO记录中标注文件名称为HG-U133。

在discovery studio中对网格半径为10Å的配体结合位点进行对比对接。MJ在肺癌细胞转运蛋白GLUT1 (PDB id 4PYP)中与负结合能结合图9A, B和己糖激酶2 (PDB id 2NZT)图9C, D[34]。

在网上用MJ类似物β-非葡萄糖苷(BNG 601(A))观察到参与结合的氨基酸，估计结合自由能为-5.72kcal/mol GLUT1。BNG通过Asn 288(A)、Asn 317(A)、Glu 380(A)三个可能的结合位点与GLUT1结合。而MJ与五个可能的结合位点Trp 388, Gly 384, Thr 30, Tyr 292和Gln 282结合，图9A, B GLUT1的结合自由能估计为-4.91 kcal/mol。这些值是在结构中10种构象的第5次运行时得到的。这表明MJ与GLUT1的相互作用比其类似物BNG强。

MJ与己糖激酶ii靶蛋白结合，图9C, D，估计结合自由能为+13.69 kcal/ mol。该值是在10次结构确认中的第9次运行时得到的。MJ与HK-II结合，形成两个氢键，如图9C, d所示为红色和蓝色菱形。MJ与HK-II的Pro 157、Ser 155、Thr172、Gly 233、Ser 234、Gly 262和trp261 7个残基结合。

在目前的研究中，我们已经建立了MJ在减弱人肺癌A-549细胞增殖方面的治疗潜力。MJ(0.01和0.1 mM)处理的黑莓果实提取物可增强对A549细胞和HL-60细胞增殖的抑制作用，并诱导HL-60细胞[5]的凋亡。MJ已被证实对不同的癌细胞[8]有作用机制，美国环境保护署(EPA)的报告表明，即使通过任何途径进入人体，对正常细胞[7]也没有毒性。

基因表达差异注释的微阵列数据分析表明，转运蛋白家族在SCLC肺癌细胞中高度差异表达，其中葡萄糖通道的线粒体己糖激酶II (HK2)和葡萄糖转运蛋白1 (GLUT 1)是癌症治疗的潜在靶点。细胞的生存需要营养，而葡萄糖是所有类型细胞的主要营养。葡萄糖的转运是由葡萄糖通道介导的，因此SCLC的非氧合细胞通过GLUT-1积极摄取葡萄糖[35,36]。酵素HK2从细胞质葡萄糖和线粒体ATP中产生葡萄糖6-磷酸。电压依赖性阴离子通道(VDAC)从细胞质中运输ADP和无机磷酸盐在线粒体中构建ATP，再将ATP从线粒体运输到细胞质。这有利于向HK2提供ATP。这增加了HK2对葡萄糖、ATP和VDAC的亲和力，导致癌细胞生存优势，称为Warburg效应[8,37]。这增强了厌氧葡萄糖代谢并产生乳酸，增加了“肿瘤酸中毒”更适合定植、侵袭的肿瘤细胞[38]。HK2与VDAC[40]的n端疏水区紧密结合200倍，这种结合保护肿瘤细胞免受线粒体外膜渗透(MOMP)导致细胞死亡[40]。

癌细胞通常比正常细胞更缺乏营养，以延长它们的高增殖速度。这表现为，较高的葡萄糖消耗和厌氧糖酵解导致乳酸的积累，而肿瘤细胞外乳酸的活跃分泌显著促进细胞外环境的酸化，促进肿瘤酸中毒[41]。这使得肿瘤组织周围的环境更适合癌细胞的定植和侵袭。此外，乳酸还通过激活β1整合素和血管生成，刺激内皮细胞中血管内皮生长因子(VEGF)的产生，增加了细胞外酸中毒[42]。葡萄糖通过扩散进入细胞，主要依赖于glut1。除了表达上调外，肿瘤细胞中GLUT-1的活性比健康细胞[43]高10-12倍。在这种情况下，MJ通过与5个氨基酸残基相互作用，结合glut1的中心通道，这对葡萄糖的运输至关重要。这将终止靶细胞内的葡萄糖转移，导致肿瘤细胞缺氧死亡。

己糖激酶(HK)有四种亚型，是肿瘤治疗的潜在靶点，其中HK2亚型在肿瘤细胞中通过氧化糖酵解高表达，被称为Warburg效应[38]。HK2与葡萄糖、ATP和VDAC[40]相互作用。从细胞质葡萄糖和线粒体ATP中产生葡萄糖6-磷酸。VDAC位于细胞的关键位置，形成线粒体和细胞代谢之间的主要界面。VDAC是NAD+/ NADH、ADP/ATP、琥珀酸、柠檬酸、Ca++等代谢物交换的主要途径，VDAC1是线粒体代谢物进出的把关人，从而控制线粒体与细胞质之间的交感作用。虽然VDAC在溶质和代谢物运输的生理过程中起着主要作用，但它也被认为是线粒体介导的细胞凋亡[44]的关键蛋白。

MJ的整体机理如图10所示。在本例中，MJ与HK-2紧密结合，干扰HK2中ATP的活性位点，重叠ATP核苷酸的腺苷环，导致癌细胞中ATP耗损。在癌细胞[37]中，HK2与线粒体外膜(OMM)的VDAC孔疏水区结合，形成HK/VDAC复合体。MJ诱导HK脱离其VDAC锚点，因为MJ保留了HK2的ATP结合位点。当这种情况发生时，Bax/Bcl-xl平衡被改变，抗凋亡的Bcl-xl蛋白从OMM中释放，促凋亡蛋白占据其位置，诱导凋亡发生的内在方式[45]。

图10 A步骤1显示单孔转运蛋白GLUT 1促进葡萄糖向细胞质的转运。第二步，当MJ与GLUT 1的中心通道结合并干扰时，促进葡萄糖的运输。OMM:线粒体外膜，IMM:线粒体内膜，IMS:线粒体内空间ECS:细胞外空间。图10 B step1显示Warburg效应，包括HK-II与VDAC结合，增加癌细胞代谢。step2 MJ占用HK II的绑定位点，无法绑定VDAC通道。第三步，促凋亡的Bax替代抗凋亡的Bcl-xl, Bad保留在VDAC上。第四步，HK-II不能与VDAC结合，因为促凋亡分子已经保留了这个位置。第5步，促凋亡分子负责将细胞色素c与线粒体内膜心磷脂结合释放到线粒体内空间，并因细胞内产生氧化应激或负责DNA碎裂导致细胞凋亡。

MJ具有4.937mM和7.822mM IC50和IC的肺癌新治疗方法的潜在价值₉₀对A-549肺癌细胞系的影响。MJ直接结合GLUT1阻断高糖酵解肿瘤细胞的葡萄糖摄取，GLUT1对葡萄糖转运至关重要。MJ与五个残基(Trp 388, Gly 384, Thr 30, Tyr 292, Gln 282)结合glut1的中央通道。MJ的额外参与是将HK2从VDAC中分离出来。MJ的结构可以根据结合能在硅模型中进一步修改，从而产生更精确的靶向药物。目前的结果表明，MJ介导的抗癌活性机制有待进一步研究。