背景：酶是一种蛋白质，它能催化活细胞中的化学反应，如生物合成和衍生物。在酶的反应中，过程开始时的分子称为底物，它们被转化成不同的分子，称为产物。生物细胞中的几乎所有过程都需要酶来进行催化反应。使用纯化酶产生有用的产品或服务构成酶技术。酶在工业、医药研究等方面有着广泛的应用。其中一种重要的工业酶是角朊酶。它是一种细胞外和蛋白水解酶。

方法：通过使用形态学方法和生物化学测试，从家禽污染的土壤鉴定中分离出角蛋白溶解细菌。进行酶生产，然后进行部分纯化方法，如盐析技术，透析和离子交换色谱。

结果:从家禽废物中分离细菌菌株，并在脱脂乳琼脂培养基上评价它们的角蛋白溶解活性。从土壤样品中分离出角蛋白降解细菌或角蛋白溶解细菌培养物，研究了角蛋白溶解培养的克拉族特征，克巨头性质和运动性。它是革兰根负短杆，在自然界中的非运动和殖民地特征和形态学。还研究了角蛋白溶解培养的生化睾丸，并发现了它们的结果。在温度25-50℃和pH 5.5-9.5之间观察到酶产生，在35℃下观察到最高酶活性，观察到酶活性降低，随着40℃的温度升高。在pH7中获得最高的酶活性。然而，对酶产生的进一步增加了pH的进一步增加。据报道，伪霉素属分泌的蛋白酶在宽范围的pH（7.0至9.0）和温度（30℃至40℃）下呈现活性。

偶角蛋白，角蛋白，角蛋白溶解细菌。

背景：酶是一种蛋白质，它能催化活细胞中的化学反应，如生物合成和衍生物。在酶的反应中，过程开始时的分子称为底物，它们被转化成不同的分子，称为产物。生物细胞中的几乎所有过程都需要酶来进行催化反应。使用纯化酶产生有用的产品或服务构成酶技术。酶在工业、医药研究等方面有着广泛的应用。其中一种重要的工业酶是角朊酶。它是一种细胞外和蛋白水解酶。

方法：通过使用形态学方法和生物化学测试，从家禽污染的土壤鉴定中分离出角蛋白溶解细菌。进行酶生产，然后进行部分纯化方法，如盐析技术，透析和离子交换色谱。

结果:从家禽废物中分离细菌菌株，并在脱脂乳琼脂培养基上评价它们的角蛋白溶解活性。从土壤样品中分离出角蛋白降解细菌或角蛋白溶解细菌培养物，研究了角蛋白溶解培养的克拉族特征，克巨头性质和运动性。它是革兰根负短杆，在自然界中的非运动和殖民地特征和形态学。还研究了角蛋白溶解培养的生化睾丸，并发现了它们的结果。在温度25-50℃和pH 5.5-9.5之间观察到酶产生，在35℃下观察到最高酶活性，观察到酶活性降低，随着40℃的温度升高。在pH7中获得最高的酶活性。然而，对酶产生的进一步增加了pH的进一步增加。据报道，伪霉素属分泌的蛋白酶在宽范围的pH（7.0至9.0）和温度（30℃至40℃）下呈现活性。

偶角蛋白，角蛋白，角蛋白溶解细菌。

角蛋白是毛发、指甲、蹄、羊毛和羽毛以及皮肤最外层上皮细胞的纤维结构蛋白家族。角蛋白是氨基酸的多肽链。角蛋白纤维的长度取决于它们所含的水分，复杂的水合作用使它们的长度增加10-12%。根据角蛋白的物理性质、组织学和化学组成可将其分为两类。软角蛋白是表皮的外层，本身就是软角蛋白的典型例子。这种材料最容易从牛鼻子和嘴唇的厚皮中分离出来。硬质角蛋白-角，指甲，爪和蹄是典型的硬质角蛋白。硬角蛋白的特点是硫含量较高，主要以半胱氨酸的形式存在，最多可达5%。角朊酶是一种细胞外酶。它在本质上是一种蛋白质水解酶。 It was classified a Proteinase of unknown mechanism as recommended by the nomenclature, the committee on the international union of biochemistry with EC number 3.4.99 [1]. recently some worker defined keratinase as serine protease due to its 97% sequence homology with alkaline protease and it is also inhibited by same inhibitor that inhibit serine protease.

角质蛋白酶为许多商业行业带来了革命，如洗涤剂，药物，皮革行业等。角蛋白酶优选比考虑其广谱的底物特异性的任何其他常见蛋白酶。以下是角蛋白酶的应用。Gupta和Ramnami也提出了角蛋白酶的洗涤剂应用[2]。它们可以降解纤维蛋白，意为角蛋白酶是在洗涤剂中实施的最有效的酶，因为它们可以去除油分裂，水果南瓜和其他强污垢菌株的菌株。皮革工业中的角蛋白酶用于皮革的软化和嫩化。角蛋白酶也用于降低低质量和损坏的羊毛。大号角蛋白浪费来自屠宰场，皮革和毛皮植物污染土壤和空气。转化含角蛋白的废物的传统方法是能量效率低;但是角蛋白酶的降解是环保和节能的方法。朊病毒蛋白是可造成的透光神经变性疾病的致病剂，包括Scarapi，牛海绵状脑病（疯牛病）。 Keratinase can degrade these proteins [3].

从某些细菌菌株分离的角朊酶也用于静脉堵塞的处方药物。在制药工业中，角蛋白酶用于制作软膏、药品等。

角朊酶仅在含角蛋白的底物中产生，主要攻击角蛋白底物[4]的二硫键(-s-s-)。许多研究者报道了各种微生物产生角朊酶的情况。结果表明，在碱性pH和接近嗜热温度条件下，真菌、链霉菌和细菌都能产生角蛋白酶。这些酶具有广泛的底物特异性，可降解纤维蛋白、弹性蛋白、胶原蛋白等纤维蛋白及其他非纤维蛋白如酪蛋白、牛血清白蛋白、明胶等。角蛋白是一种不可溶的大分子，需要细胞外酶的分泌才能被生物降解。角蛋白由长多肽链组成，对非底物特异性蛋白酶的活性具有抗性。相邻的链是由二硫化物键连接的，这是负责角蛋白的稳定性和抗降解。角化物质的降解在医学和农业上都具有重要意义[5,6]。角化酶的分泌与皮肤真菌有关，其中角质蛋白是主要底物[6]。许多工作者报道了各种生物产生角朊酶的情况。 It was found that keratinase produce by fungi, Streptomyces and bacteria were produced in nearly at alkaline pH and almost thermophilic temperatures. These enzymes have a wide range of substrate specificity for fibrous protein fibrin, elastin, collagen and other non fibrous protein like casein, bovine serum albumin, gelatin etc.

研究了羽毛角蛋白的增溶作用。用含巯基乙醇和蛋白质变性剂(如尿素)的溶液或含巯基乙醇和阴离子表面活性剂(如DBS)或十二烷基硫酸钠([7])的溶液处理鸡体羽样品。目前的研究集中在细菌来源的角朊酶在含角朊化合物工业处理中的潜在应用。角蛋白和其他不溶性蛋白一般不被认为是常见蛋白酶[8]的底物。然而，它的水解受到特定蛋白酶(角朊酶)的影响，这些蛋白酶在某些种类的芽孢杆菌[9]中已经发现。从家禽粪便中分离到羽毛降解菌。其中枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌3株均能有效降解羽毛，分别产生142、96和109单位的角化酶活性。枯草芽孢杆菌产酶的最佳条件为40℃、pH 5.0 ~ 9.0，短小芽孢杆菌产酶的最佳条件为40℃、pH 5.0 ~ 6.0，蜡样芽孢杆菌产酶的最佳条件为30℃。分别培养84、72、60小时后，枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌的最大角化酶活性分别为161、149、117单位/ml。可溶性蛋白的产生与角化蛋白酶[10]的产生趋势相同。 Keratin hydrolysates were prepared from goat and sheep hairs. The hairs were hydrolyzed under controlled alkaline conditions and the materials were neutralized to pH 7.0 to 8.0 and then filtered. Then the filtrate was concentrated to solid contents, which was further dried and made into powdered form [11]. Keratinase from Streptomyces spp. was extracted and found to degrade keratin from human epidermis. They purified the enzyme by DEAE-cellulose column. Pseudomonas aeruginosa strain isolated from poultry waste was tested for its abilities to hydrolyze the feather. The effect of different production parameters such as pH, temperature, carbon source, nitrogen source, incubation time, inoculums size was studied by isolated stain [12]. Determine the keratinolytic ability of a range of bacteria and subsequently, to characterize the keratinase showing the greatest biotechnological potential [8]. The keratinolytic ability of the purified Proteinase was examined by incubation with the insoluble substrate, keratin azure, feather meal and native and chicken feather downs [4]. The main objectives of Isolation, characterization and partial purification of extra cellular enzyme keratinase are Isolation of keratinase producing bacteria from poultry waste, identification of bacteria, up to genus level. isolation of keratinase enzyme, determination of crude, partially purified enzyme activity and characterization of enzyme.

从家禽区收集含有角蛋白溶解细菌的土壤样品。将约1克的家禽废物悬浮在9毫升盐溶液（0.9％NaCl）中。将0.1ml悬浮液连续稀释，然后在该板的乳琼脂平板上展开该板的孵育在37℃下进行24小时。从土壤中分离角蛋白溶解细菌细菌菌株从家禽废物中分离出来，并在脱脂乳琼脂培养基上评价它们的角蛋白溶解活性。Chucker和Cohn方法研究了“角蛋白酶”分离素克自然和“角蛋白酶”克的培养，形态学和生化特征的研究。进行生化，通过悬挂法观察和运动性。

硫化氢生产从纯培养转移接种物到无菌三糖铁琼脂倾斜。接种管35-37℃孵育24小时。结果是确定的。TSIA中存在一种铁化合物。铁离子(Fe^２＋）对硫化物离子具有高亲和力。结果表明h₂S与铁结合制成FeS，作为空白化合物。在含有产生硫化氢的细菌的TSIA试管中，琼脂从FeS变成黑色。吲哚试验:检测生物体将色氨酸分解为吲哚的能力。方法:无菌蛋白胨水接种培养24h。孵育后，加入科瓦奇试剂分析色氨酸的分解。甲基红试验:用于检测生物体产生和维持葡萄糖发酵产生的稳定酸性终产物的能力。方法:在MR - VP肉汤中接种一环含MR指示剂的培养物，培养24小时。Voges Prosakeur-检测乙酰甲基甲醇的生产，丙酮酸在葡萄糖发酵过程中形成的天然产物。方法:在MR - VP肉汤中接种一环含Barritt试剂的培养物，孵育24小时。枸橼酸利用试验-确定生物体是否能够利用枸橼酸作为唯一的碳源进行代谢并产生碱度。 Method: Streak a Simmons’s Citrate agar plate with the organism and incubate at 37°C for 48 hrs. Gelatin liquifaction Test: For this gelatin agar media was produced and bacterial suspension of isolated strain was spot inoculated in the centre of medium plate and incubated at 37°C for 24 hrs. for the growth development. After incubation, HgCl₂添加并导致清除区域，表明该测试是正的。

接种物在其鉴定和表征接种到羽毛基础培养基中的鉴定和表征后制备所选择的细菌菌落。在35℃下在振荡器培养箱上孵育7天。孵育7天后的酶 - 将10ml培养基转移至500mL培养基。所有孵育均在35℃下进行，连续摇动。

过滤：通过Whatmann No.1滤纸过滤培养基以除去未扩张的残基。

离心：孵育后，收集肉汤并以10,000rpm以4℃离心10分钟。弃去了含有额外细胞分泌物和沉淀的上清液。

偶氮角蛋白的制备方法与偶氮白蛋白的制备方法相似。用偶氮白蛋白作底物比色法测定消化性和胰蛋白酶活性。制备了球磨羽毛粉[5]。将1克羽毛粉(角蛋白来源)与20毫升去离子水一起放入100ml圆底反应瓶中。悬浮体与磁力搅拌器混合。将2 ml 10% NaHCO (w/v)混合到羽毛悬浮液中。在一个单独的10ml试管中，174 mg磺胺酸溶解在5ml 0.2N NaOH中。然后将69毫克的NaNO3添加到试管中并溶解。解决方案与0.4毫升的5 n盐酸酸化,混合2分钟和中和通过添加0.4毫升的5 n氢氧化钠溶液添加到羽毛角蛋白悬浮液和混合10分钟。不溶性azo-keratin的反应混合物过滤,用去离子水彻底清洗。偶氮角蛋白悬浮于水中，50℃摇匀2小时，再次过滤。 This wash cycle was repeated until the pH of the filtrate reached 6.0-7.0 and the spectrophotometric absorbance of the washing at 450 nm was less than 0.01 [13]. Finally, the wash cycles were repeated at least twice using 50 mM Potassium phosphate buffer, pH 7.5. The azo-keratin was washed once again with water and dried in vacuum overnight at 50°C. The resulting product is a chromogenic substrate that can be incubated with enzyme solution to produce and release soluble peptide derivatives that cause an increase in light absorbance of the solution [13].

硫酸铵沉淀：70ml上清液用于硫酸铵的80％硫酸铵。所有后续步骤在4°C下进行。通过以10000rpm离心10分钟，得到所得沉淀物。将沉淀物溶于50mM磷酸盐缓冲液中。

透析原理：透析是一种分离技术，通过选择性和被动扩散通过半透膜来促进在溶液中从大分子中除去小的不需要的化合物。将样品和缓冲液溶液置于膜的相对侧。然后将膜质素的样品分子保留在膜的样品上，但小分子和缓冲盐通过膜自由通过，降低样品中这些分子的浓度。改变透析缓冲液除去不再在样品中的小分子，并允许更多的污染物扩散到透析液中。以这种方式，样品内的小污染物的浓度可以降低到可接受或可忽略的水平。

诸如酪氨酸和色氨酸等酚类基团与Folin的试剂反应，并在660nm处具有最大吸收的蓝色复合物。通过与BSA作为基材进行比较，可以检测蛋白质浓度。将0.1-7mg / ml的BSA（1mg / mL）的不同溶液加入碱性硫酸铜，并孵育30分钟。通过在μg中绘制OD Vs浓度的图来测定酶的蛋白质浓度。

用纯化后的酶进行酶学优化。对酶进行了优化，确定了pH和温度对酶活性的影响。温度的影响温度对角蛋白酶活性的影响是由添加20μl角蛋白酶(3毫克/毫升)到1.5毫升磷酸盐缓冲剂(100更易与pH值7.5)包含15毫克偶氮角蛋白,和孵化的温度范围(25岁,30岁,35岁,40岁,分光光度法测定肽释放量(280 nm;1单位活性(U)引起酶量增加1.0A 280单位1分钟内)。pH值的影响,温度对角蛋白酶活性的影响是由添加20μl角蛋白酶(3毫克/毫升)到1.5毫升磷酸盐缓冲剂(100更易)与不同的pH值(5.5,6.0,6.5,7.0,705,8.0,8.5,和9.0)包含15毫克偶氮角蛋白,和孵化35°C 10小时。分光光度法测定肽释放量(280nm;1单位活性(U)引起酶量增加1.0A 280单位1分钟内)。

离子交换色谱：操作步骤-10 ml色谱柱使用玻璃柱制备，附泵和适配器，允许1-2 ml/min的流速。用25毫升高盐缓冲液再生(50毫米缓冲液在pH 7.5加0.1M NaCl)。用50-100毫升的平衡缓冲液(pH 7.5下的50 mM缓冲液)平衡柱，检查样品是否有超过50 mM的NaCl或KCl。如果有，必须在使用前彻夜透析。如果从裂解液开始，则无需在36小时内进一步制备样品。为以后的分析保留一个裂解液样本。在微管中冷冻。样品加载，保持1-2 ml/min的流速。用3柱体积的平衡缓冲液清洗。用等分子量(40 ml)或梯度洗脱(总100 ml)对蛋白进行洗脱。 8 ml fractions throughout this step was collected. Follow up with a High Salt buffer wash to remove any tightly bound proteins and regenerate your resin for the next use. 8 ml fractions throughout this step were collected. Each tube of or the protein for total protein concentration was analyzed.

离子交换色谱：制备使用玻璃塔的步骤-10mL柱，泵和适配器附着并允许1-2mL / min流速。用25毫升高盐缓冲液再生(50毫米缓冲液在pH 7.5加0.1M NaCl)。用50-100毫升的平衡缓冲液(pH 7.5下的50 mM缓冲液)平衡柱，检查样品是否有超过50 mM的NaCl或KCl。如果有，必须在使用前彻夜透析。如果从裂解液开始，则无需在36小时内进一步制备样品。为以后的分析保留一个裂解液样本。在微管中冷冻。样品加载，保持1-2 ml/min的流速。用3柱体积的平衡缓冲液清洗。用等分子量(40 ml)或梯度洗脱(总100 ml)对蛋白进行洗脱。 8 ml fractions throughout this step was collected. Follow up with a High Salt buffer wash to remove any tightly bound proteins and regenerate your resin for the next use. 8 ml fractions throughout this step were collected. Each tube of or the protein for total protein concentration was analyzed.

蛋白质浓度= OD×样品稀释/延伸系数×路径长度

OD= 280nm处的光密度

延伸系数=消光系数为1，因此1个OD = 1mg / ml蛋白质。

pathlength =使用1 cm比色皿时，pathlength为1

样品稀释=样品用1ml稀释

计算在1cm比色皿中测量的蛋白质的消光系数[14-16]。

从家禽废物中分离细菌菌株，并在脱脂乳琼脂培养基上评价它们的角蛋白溶解活性。从土壤样品中分离出角蛋白降解细菌或角蛋白溶解细菌培养物，研究了角蛋白溶解培养的克拉族特征，克巨头性质和运动性。它是克负阴性短杆，非运动在自然界和殖民地特征和形态学（图1-8）。还研究了角蛋白溶解培养物的生化睾丸，结果显示了（图1-8）。在温度25-50℃和pH 5.5-9.5之间观察到酶产生，在35℃下观察到最高酶活性，观察到酶活性降低，以高于40℃。在pH7中获得最高的酶活性。然而，对酶产生的进一步增加了pH的进一步增加。据报道，伪霉素属分泌的蛋白酶在宽范围的pH（7.0至9.0）和温度（30℃至40℃）下呈现活性。

如图1-7所示，含有良好的菌落的殖民地特征，含有在室温下在室温下孵育的角质层溶血琼脂的营养琼脂。进行碳水化合物利用试验。还进行了生化测试。根据Burgeys的报道，进行睾丸，用于鉴定细菌达到属级别。发现分离的菌株可能属于属假单胞菌．

根据BSA蛋白质的标准曲线，获得透析样品浓度的原样，得到约36.48mg / ml。

从离子交换色谱中截取完全约60分。分数35至55显示了OD的最大值。因此，它们被汇集并储存以进行进一步研究。

图4显示了离子交换色谱中所选组分的酶活性，以及根据公式所选组分的酶活性(图4-8)。

本实验是在先前确定的酶的最适pH下进行的。根据观察表，酶的最大活性在35°C。因此，35℃是角朊酶的最适温度。

当我们净化酶时，酶活性从粗酶样品到离子交换色谱样品的增加。

与15分钟反应后对照相比，角蛋白酶活性的单位为280nm的吸光度增加0.01单元[17]。

从家禽废物隔离的角蛋白溶解细菌并被确定为假单胞菌种类．它们显示出碱性角蛋白酶的生产。调查培养条件优化碱性角蛋白酶生产。

本研究的目标是提高生产，这些产量已经达到了pH，温度等的培养条件。

分离酶的最大酶活性在pH7.0和温度35℃下示出。部分纯化在离子交换色谱上，活性增加。

C₆H₁₂O₉：柠檬酸二水合物，CaCl₂.2H.₂O：氯化钙二水合物，HCl：盐酸，K.₂HPO:磷酸二钾，LM:光学显微镜，MgSO₄.7H2O：硫酸镁七水合物，NA₂Mg EDTA：EDTA镁数二钠，纳米_3.：硝酸钠，NaOH：氢氧化钠，（NH₄）₅[Fe（C1H₄O₇）2]：柠檬酸铁，OD：光学密度，过去：古生物学统计软件包，SP.:种，TLC：薄层色谱，UV /VIS：紫外/可见。

不适用

不适用

不适用

这是相应作者的学士学位自筹资金项目。

作者在整个研究项目完成过程中受到了高度贡献。

A.营养琼脂培养基的组成

B.乳琼脂介质的组成 -

C.蛋白胨水肉汤的组成 -

D.试剂制备 -