确定细菌性疾病的植物的易感性的方法，所述方法包括感染植物的植物材料与一种细菌物种特异性的植物病害的细菌的步骤。要做到这一点，该方法包括获得从植物叶样品，感染从与所述细菌种类特异于植物病害的细菌的植物中获得的叶样品，维持叶样品活着，并且通过确定细菌生长的步骤检测由所述细菌产生的生物聚合物。技术TCPDF（www.tcpdf.org）。

确定细菌性疾病的植物的易感性的方法，所述方法包括感染植物的植物材料与一种细菌物种特异性的植物病害的细菌的步骤。要做到这一点，该方法包括获得从植物叶样品，感染从与所述细菌种类特异于植物病害的细菌的植物中获得的叶样品，维持叶样品活着，并且通过确定细菌生长的步骤检测由所述细菌产生的生物聚合物。技术TCPDF（www.tcpdf.org）。

本发明涉及确定的细菌性疾病的植物的易感性的方法，所述方法包括感染植物的植物材料与一种细菌物种特异性的植物病害的细菌的步骤。植物疾病有各种原因，如营养不良，病毒感染或细菌感染。相对于后者，致病（病因）的细菌可以通过经由气孔，所述hydratodes或损伤（损伤）侵入它和乘法有感染的植物。携带了这种病菌的植物减少了商业价值或者是甚至出现亏损。它可能不会被允许工厂出口。如果期望以创建对于所述细菌性疾病抗性的植物，植物是相对容易受到细菌感染是显然不适合作为原料。如果用于测试的植物或植物材料，开发了疾病的症状，这显然是受到感染。但是，如果症状不发展，那么植物可为运营商或它可抵抗。在前一种情况下，该工厂是宽容的，但仍然不适合出口和/或繁殖和/或传播。本发明的目的在于提供一种能够相对于植物分级至其能力以抵抗细菌感染的方法。

为此，根据该前导码的方法的特征在于，该方法包括获得从植物叶样品，感染与细菌物种特异性的植物疾病的细菌从植物得到的叶子样品的步骤，保持叶样品活，并通过检测由所述细菌产生的生物聚合物来确定细菌的生长。

而不是依赖于视觉外观的变化，如形态变化或植物材料的颜色，细菌的生长本身是确定的。如果没有细菌生长，这种植物是完全抗细菌的。如果在视觉外观没有变化的情况下仍有细菌生长，则该植物是耐受的。

可使用任何合适的方法，例如在遗传修饰的细菌的情况下的荧光来测定细菌生长。更多的荧光表明更多的细菌。引起植物疾病的细菌可使用常规方法制备引入了对荧光蛋白的荧光基因如GFP。为此，所述细菌物种可以遗传通过引入携带该基因的荧光蛋白的质粒的工程。一般情况下，也将有一个基因编码抗生素抗性，容易地选择成功地工程化的细菌。

对于植物物种和病原体的特定组合的常规测量，没有必要使用控制(空白)，因为检测到的代表生物聚合物的典型信号水平是已知的。

植物性样品的温育时间是在一般多天，诸如一至四周。为了减少由不同的细菌物种或由真菌叶样品亡由于攻击，叶样品是在接种细菌物种之前优选是无菌的风险。这方便地实现，如果要测试的植物tissuecultured植物，其在无菌条件下生长。接种后，将接种叶优选由污染其它传染性物质屏蔽。

根据有利的体现,进一步控制从我选择使用)叶的抗植物样本,ii)进一步叶样本进一步植物,进一步说,植物和植物都是相同的克隆,其中控制不是特定的植物疾病的细菌感染。这样就可以更准确地判断是否发生了增长。因为克隆的植物是相同的，它们的基因决定的抗性属性也将是相同的。

根据有利的实施例，在感染叶样本的步骤之前，执行灭菌步骤。植物可以作为一个整体进行消毒，但最好是对叶子样本进行消毒。使用液体，特别是消毒气体或液体，如次氯酸水溶液，可以方便地进行消毒。这有助于确保检测到正确的细菌，并/或增加在方法持续期间植物物质存活的可能性。

根据一个重要实施例，获得叶片样本的植物保持存活。如果获得植物材料的植物是许多基因相同的植物之一(例如克隆获得的)，那么获得植物材料的植物可能会被牺牲。对于许多其他应用，特别是育种或繁殖，保持植物原料来源的植物活着有利于实现这一目标。保证植物存活的措施可以通过任何方式来实现，只要植物的至少一个细胞或组织样本能够存活，就足以长成完整的植物。最不敏感的植物最好用于育种。

根据有利的实施例中，叶样品粉碎并进行多核酸扩增，所述生物聚合物检测是用于用于感染细菌扩增的多核酸特异性的。

多核酸可以是DNA或RNA。术语“细菌特异性”并不意味着扩增的多核酸是自然的、内源性的DNA或RNA。这种细菌可能是经过基因工程改造的，扩增的延伸可能是一种标记物，例如特定的抗生素抗性基因。这省去了对用于感染的细菌种类进行测序的麻烦。

根据一个有利的实施方案中，扩增是用PCR.This方法很适合于自动化进行。另外，也可以监测PCR反应的进行，因此，如果明确地检测到细菌生长，扩增可以被停止以节省时间。

根据一个有利的实施例，放大循环的数目被用作细菌生长的量度。因此，如果有细菌生长，可以提前终止扩增，节省时间。

根据有利的实施例，该植物为兰花种。这是一个重要的应用领域。酸败是造成兰花经营亏损的重要原因，也是兰花重要的具体应用领域。

根据有利的实施例，植物样本被维持在一个容器中，该容器中至少有一个i)气孔和ii)叶片样本材料表面朝上的切口。

这有助于细菌在感染叶片样本后保持在其表面，避免它们被转移到容器中，减少了叶片样本被细菌入侵的机会。因此，它们更有可能感染叶片样本。大多数植物的叶子在叶子的两侧都有气孔，兰花是例外。根据有利的实施例，将叶片样品置于应力条件下。这种胁迫条件使得叶片样品对细菌的侵染更加敏感，从而更容易和/或更快地确定植物对侵染的敏感性。

对植物材料来说，胁迫条件最好不是缺乏湿度。例如，胁迫条件是较高或较低的温度，与获得叶片样本的植物生长的平均温度偏差超过2˚C，最好至少为5˚C。

最后，根据一个有利的实施例，该植物为兰花种，该叶样本被遮挡，而该叶样本保持存活。

这已被发现可以减少测定敏感性所需的时间。优选至少有50%的光线被阻挡，优选至少有90%，更优选至少有96%。根据有利的实施例，在叶片样品至少再孵育一天之后，对叶片样品至少再进行一次细菌生长的测定。

这有助于提高方法的可靠性，以防树叶样本碰巧被感染得更慢。早期的叶片样品基本上作为对照，有助于更准确地确定细菌生长的程度。优选地，该叶样品包括至少两个叶或叶段。进一步的潜伏期最好是三天，最好是一周。根据有利的实施例，在叶片样品与细菌接触后至少一天内，相对空气湿度至少为90%。

这有助于保持细菌的生存能力，以便给它们足够的机会感染树叶样本。优选地，使用固定化水作为水蒸气的来源，例如作为凝胶(如琼脂凝胶)来保持湿度。这降低了污染的风险。最好保持相对湿润的环境至少一周，从接种日起至少10天，因为这有助于植物材料抵御细菌。相对湿度优选≥95%，优选≥98%，甚至优选≥>99%[1-3]。

本发明现在将参考下面的实施例部分示出。

对于根据本发明检测细菌疾病敏感性的方法，必须使用致病性菌株。适宜的病原菌为牛酸杆菌(Acidovorax cattleyae)， ATCC号:33619，是蝴蝶兰属(蝴蝶兰属)一种细菌性疾病的病原。实验用的牛酸杆菌在培养皿中琼脂培养基上生长，每500ml水准备，

调整pH至7.4，然后在121˚C下蒸压20-30分钟。在琼脂凝固前加入以下抗生素:

接种后，用薄膜密封培养皿，在28˚C下培养7 d。

摘取单个菌落，并在Erlenmeyer烧瓶中，在20ml具有相同成分但没有琼脂的液体培养基上生长，直到达到对数相。

为了确定对于给定的光密度的细菌浓度，五十倍稀释，用灭菌自来水制成并镀以一式两份对培养皿（100微升每皿）。另外，浊度为使用便携式ISO浊度测量装置中的所有细菌悬浮液来确定（HI 98713，HANNA仪器，新教堂一个/ d艾塞尔，荷兰）。陪替氏培养皿在28℃培养一周。得到（表1）的光密度和细菌浓度之间的相关性如下。

植物材料:两种不同的蝴蝶兰品种中去实验。有对每个品种制成，根据本发明，以检查该方法的再现性和可靠性约180个克隆。克隆在遗传上相同，并且由体外微量繁殖从蝴蝶兰穗花制成（茎携带花）。克隆维持在28℃和大约2000勒克司光强度的标准的非液体生长培养基上，并转移每12-14周，以新鲜的培养基。

每周将幼苗的叶片从植株上剪下来，接种细菌悬浮液。

切叶消毒:采集在10种自然环境下生长的植物叶片外植体，对外植体进行表面消毒，防止微生物污染。这项工作是这样做的:

接种方法：对两个蝴蝶兰品种的接种方法进行了比较。

在初次接种方法中，两个最小的活跃生长的叶子从植物切割并在细菌悬浮液中浸渍和两个叶一起存储在由室温无菌陪替氏培养皿无叶样品和环境之间的光接触。的陪替氏培养皿用一黑色塑料袋遮光。

在去第二次接种的方法，所述两个最小的活跃生长的叶子从植物，则每个叶得到了在其顶表面的一小截（约5mm）的切割。然后，两个叶子在细菌悬浮液中浸渍并一起存储在由室温无菌陪替氏培养皿不叶样品和环境之间的光接触。

在第三种接种方法中，从植株上剪下两个最年轻的活跃生长的叶片，浸泡在细菌悬浮液中，然后用潮湿的无菌过滤器将它们储存在无菌培养皿中。使用了与前面方法相同的存储条件。无菌过滤器是由棉垫制成的。它们在121ºC的玻璃罐中灭菌约20分钟，然后浸泡在无菌自来水中，挤出多余的水分，放在每个培养皿的底部。然后把两片叶子都放在过滤器上。然后将培养皿在与前一种方法相同的存储条件下进行存储。在培养皿过滤器的目的是增加空气湿度，高空气湿度促进细菌生长。

接种后一周开始对接种方法进行比较。

对每种方法和蝴蝶兰品种进行取样。每次都有一片叶子从培养皿中取出，用于PCR。对每个样品测定Cq值。定量循环(quantitative cycle, Cq)是用于分析qPCR结果的度量标准。Cq值表示达到设定的荧光信号阈值所需的周期数。应该选择用于此阈值的确切级别，以便它捕获指数阶段的数据，并且对运行中分析的所有样本都是相同的。在实践中，为了确定Cq值，需要从原始数据中减去背景荧光水平。背景值通常基于前几个周期相对稳定的荧光水平。然后，手动或使用特定于仪器的算法选择一个荧光阈值。数据分析搜索每个样本的数据曲线，并插值Cq值，表示该样本越过阈值的位置。 Thus, the specific Cq obtained is a relative value. It is relative to the starting template copy number, but it is also specific for the instrument and reagents used, the efficiency of the PCR amplification, the efficiency of cleavage or hybridization of the fluorogenic probe, and the sensitivity of detection. A lower Cq correlates with a higher amount of starting template and a higher Cq value correlates to a lower amount of starting template.

在实验开始时，所有样品均接种相同数量的细菌(100 ul, OD约0.22)。每周采集样品并对样品的CQ值进行分析。如果第二个样品的CQ值比第一个样品下降，则有细菌生长。如果细菌的生长没有对样品表面造成任何损害，也没有观察到任何症状，那么该植物样品(植物品种)对疾病具有耐受性。如果细菌的生长造成了任何损害，并且观察到症状，那么样品(植物品种)对这种疾病是敏感的。如果CQ值没有变化，与第一个样本相比，既没有减少也没有增加，说明没有细菌生长。如果样品(植物品种)的末端没有细菌生长，也没有观察到任何症状，那么该样品(植物品种)被认为具有抗病能力。抗性是指植物抑制病原菌生长的能力。可以使用商业上可用的软件(如IDT Biotools)来确定检测细菌疾病的合适引物。

3.0益生元分析仪。at3619适用引物为5 ' -caagtcctca tggcccttat ag-3 '和5 ' -acggttaggc tacctacttc t-3 '(正向引物和反向引物)。

这些可以从美国爱荷华州Coralville的综合DNA技术公司获得)。

对2个蝴蝶兰品种的3种接种方法进行了比较。

a .在第一种接种方法中，从植株上剪下两个最年轻的活跃生长的叶片，浸泡在细菌悬浮液中，将两个叶片一起保存在无菌培养皿中，在室温下，叶片样品与环境之间不进行光接触。

B.在第二次接种的方法，所述两个最小的活跃生长的叶子从植物切割，然后将每个叶被设置有在其顶表面的一小截（CA0.5厘米）。然后，两个叶子在细菌悬浮液中浸渍并一起存储在由室温无菌陪替氏培养皿不叶样品和环境之间的光接触。

两个品种的PCR Cq值分别为0、15.9和16.4。Cq值表明细菌的存在和发展在每个接种品种的样品相比,第二轮样品Cq值一周前,结合可见品种出现症状2结合细菌增长表明,这个品种是敏感的,但品种1无症状，且细菌生长增加，表明存在对细菌的耐受水平。

C.在第三种接种方法中，从植株上剪下两个最年轻的活跃生长的叶子，并浸泡在细菌悬浮液中。然后将它们储存在装有潮湿无菌过滤器的无菌培养皿中。使用了与前面方法相同的存储条件。无菌过滤器是由棉垫制成的。在121˚C的玻璃罐中灭菌约20分钟，然后浸泡在无菌自来水中，挤出多余的水分，放在每个培养皿的底部。然后把两片叶子都放在过滤器上。然后将培养皿在与前一种方法相同的存储条件下进行存储。在培养皿过滤器的目的是增加空气湿度，高空气湿度促进细菌生长。

D.接种方法与取得的结果比较。

序列表：<120> Kalkanova, Hyuliya Letifova 5 <120>一种测定植物对A

1.确定细菌性疾病的植物的易感性的方法，所述方法包括感染植物的植物材料与一种细菌物种特异性的植物病害的细菌，其特征在于该方法包括以下步骤的步骤中，

2.根据权利要求1的方法,其中使用一个控制选择从我)进一步叶的抗植物样本,ii)进一步叶的进一步植物样本,进一步说,植物和植物都是相同的克隆,其中控制不是特定的植物疾病的细菌感染。

3.根据权利要求1或2的方法，其中感染叶样品的步骤之前，执行灭菌步骤。

4.根据上述任何要求的方法，其中获得叶子样本的植物保持存活。

5.根据上述任何权利要求的方法，其中叶样本被粉碎并遭受多核酸扩增，所检测到的生物聚合物为用于感染的细菌的特异性扩增多核酸。

6.根据权利要求5，其中所述扩增是使用PCR来进行的方法。

7.根据权利要求5或6中的任何一种方法，其中扩增周期的数量被用来衡量细菌的生长。

8.该方法根据任何前面的要求，其中的植物是一种兰花。

9.根据上述任何要求的方法，其中植物样品被保持在一个容器中，该容器中至少有一个i)气孔和ii)叶片样品材料朝上的表面切口。

10.根据上述任何要求的方法，其中叶片样品受到应力条件。

11.根据权利要求10的方法，其中，该植物是一种兰花物种和叶样本是屏蔽光，而说叶样本保持活着。

12.根据任一前述权利要求，其中，针对所述叶样品的叶样品的温育中的至少一个另外的后一天至少一次进行细菌生长的测定的方法。

13.该方法根据上述任何一种要求，其中，在叶片样品与细菌接触后至少一天，相对空气湿度至少为90%。